n-3多不饱和脂肪酸饮食对小鼠肥胖及相关细胞因子的影响

郑 征，葛银林*，薛美兰，秦伟伟，徐艳君，侯 琳

n-3多不饱和脂肪酸饮食对小鼠肥胖及相关细胞因子的影响

郑 征，葛银林*，薛美兰，秦伟伟，徐艳君，侯 琳

(青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室，山东 青岛 266021)

目的：研究n-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fat acids，PUFAs)饮食对小鼠肥胖程度及相关细胞因子血清水平的影响，探讨其作用机理。 方法：将健康小鼠分为高饱和脂肪酸饮食组、n-3多不饱和脂肪酸饮食组和对照组，记录每周小鼠进食量和体质量，实验结束时用ELISA法检测小鼠血清增食因子A(orexin-A)、抵抗素(resistin)、脂联素(adiponectin)水平。 结果：n-3多不饱和脂肪酸饮食组小鼠与高饱和脂肪酸饮食组小鼠相比，肥胖程度明显降低 (P＜0.05)，血清的增食因子A水平明显降低(P＜0.05)，血清的抵抗素水平明显升高(P＜0.05)，血清的脂联素水平升高但无统计学差异；n-3多不饱和脂肪酸饮食组小鼠的各项指标和对照组相比均无统计学差异。结论：n-3多不饱和脂肪酸饮食与饱和脂肪酸饮食相比，可抑制肥胖的发生和发展。

n-3多不饱和脂肪酸；肥胖；脂联素；增食因子A；抵抗素

肥胖(obesity)是机体中能量摄入大于能量消耗的一种慢性能量失衡，且多余体脂的积累对身体健康产生不利影响。现代社会肥胖症的发病率越来越高，由于肥胖的发生可导致高血压(hypertension)、2型糖尿病(type 2 diabetes)、代谢综合症(metabolic syndrome，MS)等疾病，严重威胁人类健康，因此肥胖症已成为目前世界范围内最受关注的代谢类疾病之一[1]。

食用油是人们日常生活中必须摄入的营养物质，除提供人体热能、必需脂肪酸(essential fatty acids，EFA)和促进脂溶性维生素(lipid soluble vitamin)吸收外，还有利于增强进食口感。食用油的摄入量、种类及脂肪酸组成，能够显著地影响人体中多种脂类和类脂水平的变化，从而对肥胖和相关疾病起到重要的调节作用[2-4]。食用油来源于动物脂肪和植物油脂，可分为饱和脂肪酸(saturated fatty acid)和不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid)。根据不饱和双键的位置，可将不饱和脂肪酸划分3类：n-3不饱和脂肪酸、n-6不饱和脂肪酸和n-9不饱和脂肪酸。其中n-3不饱和脂肪酸均为多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fat acids，PUFAs)，近年来发现它在肿瘤、心脑血管疾病、心脏病、风湿疾病、代谢疾病、帕金森等疾病的预防和治疗方面有显著功效，并且对于新生儿及幼儿的大脑、中枢神经和免疫系统的发育起重要作用[5-8]。

为探讨n-3多不饱和脂肪酸饮食在治疗肥胖症和其并发症中的作用，本研究以C57BL/6小鼠为实验动物，建立高饱和脂肪酸饮食组、n-3多不饱和脂肪酸饮食组和对照组3个饮食模型组，观察小鼠的肥胖程度以及小鼠血清中脂联素、增食因子A和抵抗素的表达水平。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

SPF级C57BL/6雌性小鼠 上海斯莱克实验动物有限责任公司。

标准实验动物饲料 济南康大饲料有限公司；脱脂大豆粉 青岛美辰食品公司；脱脂甜奶粉 雀巢公司；维生素AD胶丸 青岛双鲸药业有限公司；深海鱼油 美国康隆公司；其他配料购自沃尔玛超市。各组饲料配方见表1，饲料制备后4℃低温保存。

表1 各组饲料成分配方(100g)Table 1 Diet formula composition (100g)

血清脂联素ELISA试剂盒(mouse)、血清增食因子ELISA试剂盒(mouse)、血清抵抗素ELISA试剂盒(mouse) 上海西唐公司；其他试剂均为国产分析纯。

DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶标仪(配有Ascent software for Multiskan分析软件)、Wellwash 4 MK2洗板机 芬兰Thermo公司；SIGMG 1-13离心机 美国Sigma公司；PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；DW-86L626超低温冰箱、BCD-196TE冰箱 海尔公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和实验设计

36只雌性C57BL/6小鼠，适应性喂养两周后，体质量20.34～24.34g。随机分为高饱和脂肪酸饮食组、n-3多不饱和脂肪酸饮食组和对照组。高饱和脂肪酸饮食组体质量：(21.59±0.22)g；n-3多不饱和脂肪酸饮食组体质量：(21.86±0.28)g；对照组体质量：(21.62± 0.52)g。每组分为3笼，自由摄食饮水。实验动物房温度(22±5)℃，湿度(50±10)%，明暗周期12/12。每周记录每只小鼠的体质量和每笼小鼠的进食量。第18周末时采用颈椎脱臼法处死小鼠，记录每只小鼠肛门到鼻尖的长度作为体长，断头采血后分离血清，采用酶联免疫法(ELISA)检测血清中脂联素(adiponectin)、增食因子A(orexin-A)和抵抗素(resistin)的含量。

1.3 测定方法

小鼠断头采血0.5～2mL，室温下静置2h，3000r/min离心20min，分离到血清50～150μL，－70℃低温保存。分别按照小鼠血清中脂联素、小鼠增食因子A和小鼠抵抗素的酶联免疫法试剂盒说明书要求，检测3种细胞因子的浓度。

以每周称质量的小鼠体质量减去小鼠初始体质量得到每周体质量增加；每笼每周进食量除以每笼小鼠个数计算出每周平均进食量；将实验结束时小鼠的体质量体长比作为衡量小鼠肥胖程度的指标。

1.4 数据统计

采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对每周平均进食量、每周体质量增加量以及体质量体长比作统计学分析，用t检验(t-test)进行各饮食模型组间的两两比较；采用线性回归(linear regression)和相关性分析(correlation analysis)分析各饮食模型组的每周平均进食量和每周体质量增加量之间的关系；采用t检验分析各饮食模型组之间的血清脂联素、增食因子A和抵抗素水平是否有显著性差异。显著性水平设为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 体质量、体长和进食量的测定结果

对3个饮食模型组小鼠的每周体质量增加量和体质量体长比做单因素方差分析和组间两两t检验，发现高饱和脂肪酸饮食组小鼠的每周体质量增加量的平均值(P＜0.01)和体质量体长比(P＜0.05)均显著高于n-3多不饱和脂肪酸饮食组和对照组；而n-3多不饱和脂肪酸饮食组和对照组之间无显著性差异(图1、2)。表明高饱和脂肪酸饮食组小鼠的肥胖程度显著高于另外两组。

图1 3组小鼠每周体质量增加量均值Fig.1 ANOVA analysis of body weight difference between mice fed high fat diet and those fed n-3 PUFA-containing diet or common diet

图2 3组小鼠的体质量体长比Fig.2 ANOVA analysis of weight/length ratio difference between mice fed high fat diet and those fed n-3 PUFA-containing diet or common diet

对3个饮食模型组小鼠的每周体质量增加量和每周平均进食量做线性回归和相关性分析，发现高饱和脂肪酸饮食组小鼠的每周平均进食量显著高于n-3多不饱和脂肪酸饮食组和对照组(P＜0.001)，高饱和脂肪酸饮食组小鼠的每周体质量增加与每周平均进食量呈负相关(r=－0.576)，而n-3多不饱和脂肪酸饮食组(r=0.694)和对照组(r=0.701)的每周体质量增加与每周平均进食量呈正相关(图3、4)。表明高饱和脂肪酸饮食组小鼠的食欲高于另外两组，随着体质量的增加进食量有减少趋势；n-3多不饱和脂肪酸饮食组和对照组的进食量随体质量增长稳定增加。

图3 3组小鼠每周平均进食量的线性回归分析Fig.3 Linear regression analysis of weekly food intake of mice

图4 3组小鼠每周体质量增加的线性回归分析Fig.4 Linear regression analysis of weekly body weight increment of mice

2.2 小鼠血清中3种细胞因子水平的测定结果

对3个饮食模型组小鼠的血清脂联素、增食因子A和抵抗素水平做单因素方差分析和组间两两t检验，发现高饱和脂肪酸饮食组小鼠血清增食因子A显著高于另外两组(P＜0.05)，抵抗素水平显著低于另外两组(P＜0.05)，血清脂联素水平低于另外两组，但没有统计学意义(P=0.71)；n-3多不饱和脂肪酸饮食组和对照组之间没有显著性差异(图5)。

图5 血清中3种细胞因子水平与饮食类型关系Fig.5 Statistical analysis of differences in three obesity-related cellfactors between mice fed high fat diet and those fed n-3 PUFA-containing diet or common diet

3 结 论

n-3多不饱和脂肪酸是一类重要的多不饱和脂肪酸，主要包括α-亚麻酸(α-linolenic acid，ALA)、二十碳四烯酸(eicosatetraenoic acid，ETA)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。其中EPA和DHA的摄入可以显著降低高脂血症患者的脂类、脂蛋白和载脂蛋白的血清水平；增强2型糖尿病患者体内胰岛素敏感性，缓解胰岛素抵抗，降低血浆甘油三酯、类脂和脂蛋白水平；降低健康成人的体脂含量，促进脂肪利用[9-12]。本实验中，C57BL/6小鼠作为一种容易诱发饮食诱导肥胖(diet-induced obese，DIO)的小鼠品系，长期给其喂食添加n-3多不饱和脂肪酸的食物后，可有效的控制其肥胖的发生，降低其肥胖程度，说明EPA和DHA对小鼠有减肥作用，该结果与相关报道一致[12]。

肥胖的发生和发展与多种细胞因子有关。增食因子A又称为下丘脑分泌素1(hypocretin-1)，由下丘脑分泌素细胞分泌。下丘脑分泌细胞的分泌作用可被瘦素(leptin)和高血糖状态抑制，而被饥饿素(ghrelin)和低血糖状态激活，据此发现增食因子A有增强食欲、增加进食量和加速分解代谢的作用[13-15]。在本实验中，添加EPA和DHA的饲料对小鼠的食欲有降低作用。食用了EPA和DHA的小鼠与高饱和脂肪酸饮食小鼠相比，血清中增食因子A水平相对降低。作为一种调节食欲的细胞因子，增食因子A的血清水平降低的同时，小鼠食欲也降低，这可能是由于EPA和DHA的摄入使小鼠在进食后容易产生饱感，小鼠下丘脑的食欲调节网路(appetite regulation network，ARN)通过各种信号传递作用，降低了增食因子A的表达。与对照组相比，n-3多不饱和脂肪酸饮食组小鼠的进食量和增食因子A血清水平虽无显著性差异，但通过饲养过程中的外观观察，发现对照组小鼠的毛色略暗且不柔顺，个别有脱毛的现象，营养状况较差。

抵抗素是由脂肪细胞分泌的与能量代谢密切相关的细胞因子，其具体作用还存在争议。有研究表明，生理条件下个体肥胖程度的增加可提高血清抵抗素的水平，而血清抵抗素水平增加则促使胰岛素抵抗(insulin resistance)程度的增加，从而减缓血糖贮存为体脂的趋势[16-19]。本实验中，n-3多不饱和脂肪酸饮食组小鼠的血清抵抗素水平明显高于高饱和脂肪酸饮食组，提示EPA和DHA的摄入可能是通过提高抵抗素的血清水平来调节胰岛素敏感性(insulin sensitivity)，从而减少脂肪的积累的。

脂联素是由脂肪组织分泌进入血液循环的一种蛋白类激素，对多种物质的代谢起调节作用，包括葡萄糖的调节和脂肪酸的异化作用，其表达水平和成年人体脂含量负相关[20-22]。本实验中，体质量显著降低的n-3多不饱和脂肪酸饮食组小鼠的血清脂联素水平略有升高，虽无统计学意义，但与相关报道一致[21]。

本实验通过观察每周小鼠的进食量及体质量，检测小鼠脂联素、增食因子A和抵抗素的血清水平，进一步验证了n-3多不饱和脂肪酸饮食的减肥功效，并认为其减少体脂的作用可能是通过减低食欲和调节胰岛素敏感性来实现的。然而，人们对通过神经-体液调节(neuro-humoral regulation)途径控制肥胖发生的食欲调节网路还不甚明了，脂联素等细胞因子在食欲调节网路中的地位及其对胰岛素的具体作用方式还有待进一步的研究。因此，确证n-3多不饱和脂肪酸是通过调节食欲和胰岛素敏感性来实现其减肥作用、明确具体的减肥机制是进一步研究的重点。另外，在人体内是否能得到和小鼠相似的结果，也是进一步研究的方向。

[1]HASLAM D W, JAMES W P. Obesity[J]. Lancet, 2005, 366(9492): 1197-1209.

[2]CALDER P C. Polyunsaturated fatty acids and inflammatory processes: New twists in an old tale[J]. Biochimie, 2009, 91(6): 791-795.

[3]GUIVERNAU M, MEZA N, BARJA P, et al. Clinical and experimental study on the long-term effect of dietary gamma-linolenic acid on plasma lipids, platelet aggregation, thromboxane formation, and prostacyclin production[J]. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids, 1994, 51(5): 311-316.

[4]FAN Yangyi, CHAPKIN R S. Importance of dietary gamma-linolenic acid in human health and nutrition[J]. J Nutr, 1998, 128(9): 1411-1414. [5]BUCHER H C, HENGSTLER P, SCHINDLER C, et al. N-3 Polyunsaturated fatty acids in coronary heart disease: a meta-analysis of randomized controlled trials[J]. Am J Med, 2002, 112(4): 298-304.

[6]de DECKERE E A. Possible beneficial effect of fish and fish n-3 polyunsaturated fatty acids in breast and colorectal cancer[J]. Eur J Cancer Prev, 1999, 8(3): 213-221.

[7]SINN N, BRYAN J. Effect of supplementation with polyunsaturated fatty acids and micronutrients on learning and behavior problems associated with child ADHD[J]. J Dev Behav Pediatr, 2007, 28(2): 82-91.

[8]BOUSQUET M, SAINT-PIERRE M, JULIEN C, et al. Beneficial effects of dietary omega-3 polyunsaturated fatty acid on toxin-induced neuronal degeneration in an animal model of Parkinson s disease[J]. FASEB J, 2008, 22(4): 1213-1225.

[9]PHILLIPSON B E, ROTHROCK D W, CONNOR W E, et al. Reduction of plasma lipids, lipoproteins, and apoproteins by dietary fish oils in patients with hypertriglyceridemia[J]. N Engl J Med, 1985, 312(19): 1210-1216.

[10]POPP-SNIJDERS C, SCHOUTEN J A, HEINE R J, et al. Dietary supplementation of omega-3 polyunsaturated fatty acids improves insulin sensitivity in non-insulin-dependent diabetes[J]. Diabetes Res, 1987, 4(3): 141-147.

[11]MALASANOS T H, STACPOOLE P W. Biological effects of omega-3 fatty acids in diabetes mellitus[J]. Diabetes Care, 1991, 14(12): 1160-1179.

[12]COUET C, DELARUE J, RITZ P, et al. Effect of dietary fish oil on body fat mass and basal fat oxidation in healthy adults[J]. Int J Obes Relat Metab Disord, 1997, 21(8): 637-643.

[13]SAKURAI T, AMEMIYA A, ISHII M, et al. Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G protein-coupled receptors that regulate feeding behavior[J]. Cell, 1998, 92(4): 573-585.

[14]WILLIAMS K W, SCOTT M M, ELMQUIST J K. From observation to experimentation: leptin action in the mediobasal hypothalamus[J]. Am J Clin Nutr, 2009, 89(Suppl 3): 985-990.

[15]HEWSON A K, TUNG L Y, CONNELL D W, et al. The rat arcuate nucleus integrates peripheral signals provided by leptin, insulin, and a ghrelin mimetic[J]. Diabetes, 2002, 51(12): 3412-3419.

[16]DEGAWA-YAMAUCHI M, BOVENKERK J E, JULIAR B E, et al. Serum resistin (FIZZ3) protein is increased in obese humans[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2003, 88(11): 5452-5455.

[17]ASENSIO C, CETTOUR-ROSE P, THEANDER-CARRILLO C, et al. Changes in glycemia by leptin administration or high- fat feeding in rodent models of obesity/type 2 diabetes suggest a link between resistin expression and control of glucose homeostasis[J]. Endocrinology, 2004, 145(5): 2206-2213.

[18]RAJALA M W, QI Yong, PATEL H R, et al. Regulation of resistin expression and circulating levels in obesity, diabetes, and fasting[J]. Diabetes, 2004, 53(7): 1671-1679.

[19]SILHA J V, KRSEK M, SKRHA J V, et al. Plasma resistin, adiponectin and leptin levels in lean and obese subjects: correlations with insulin resistance[J]. Eur J Endocrinol, 2003, 149(4): 331-335.

[20]DIEZ J J, IGLESIAS P. The role of the novel adipocyte-derived hormone adiponectin in human disease[J]. Eur J Endocrinol, 2003, 148(3): 293-300.

[21]UKKOLA O, SANTANIEMI M. Adiponectin: a link between excess adiposity and associated comorbidities[J]. J Mol Med, 2002, 80(11): 696-702.

[22]RENALDI O, PRAMONO B, SINORITA H, et al. Hypoadiponectinemia: a risk factor for metabolic syndrome[J]. Acta Med Indones, 2009, 41(1): 20-24.

Effect of n-3 PUFA-containing Diet on Obesity and Obesity-related Cell Factors in Mice

ZHENG Zheng，GE Yin-lin*，XUE Mei-lan，QIN Wei-wei，XU Yan-jun，HOU Lin
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

Objective: To determine the effect of n-3 PUFA diet on obesity and obesity-related cell factors in mice. Methods: A total of 36 healthy female mice were randomly divided into three groups: high fat diet group, n-3 PUFA-containing diet group and control group. Body weight and food intake were recorded once a weed during the trail period and the levels of serum adiponectin, orexin-A and resistin were determined by ELISA method at the end of the trial. Results: The adiposity and serum orexin-A level in the n-3 PUFA-containing diet group were significantly lower than that in the high fat diet model group (P ＜0.05), and the level of serum resistin in the n-3 PUFA-containing diet model group was significantly higher than that in the high fat diet model group (P ＜ 0.05). Conclusion: An obvious reduction on the development of adiposity was observed in mice fed n-3 PUFA-containing diet.

n-3 PUFA；obesity；adiponectin；orexin-A；resistin

R151.4

A

1002-6630(2010)19-0342-05

2010-02-11

郑征(1982—)，男，硕士研究生，研究方向为基因治疗。E-mail：rebelzheng@gmail.com

*通信作者：葛银林(1957—)，男，教授，博士，研究方向为基因治疗。E-mail：geyinlin@126.com