沙城龙眼葡萄园土壤中酵母菌多样性研究

李 艳，卢 君，张利中

沙城龙眼葡萄园土壤中酵母菌多样性研究

李 艳1,2，卢 君1，张利中3

(1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北 石家庄 050018；3.中国长城葡萄酒有限公司，河北 沙城 075400)

为分离筛选具有产区特色的菌种，本实验采用梯度稀释和划线分离技术，从沙城地区3个龙眼葡萄园土壤中共分离得到210株酵母菌。按照形态表型分为9类，又利用核糖体5.8S rDNA-ITS区域RFLP方法将这9类酵母在分子水平上进行了区分，其中两类酵母为常见酵母，分别为东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)和热带假丝酵母(Candida tropicalis)。实验证明了该地区土壤中酵母菌的多样性。

龙眼葡萄；土壤；酵母；形态表型；RFLP方法；生物多样性

沙城葡萄酒产区地处怀涿盆地，为我国著名的葡萄产地，位于北纬40°附近，是酿酒葡萄种植最理想的黄金地带和我国重要的葡萄原料基地之一，也是我国地理标志产品“沙城葡萄酒”的原产地。

土壤是各种微生物的天然栖息地，其中蕴含着丰富的酵母菌资源。从葡萄园土壤中分离酵母菌是开发和利用优良酿酒酵母菌种的基础。本实验对沙城产区龙眼葡萄园土壤进行酵母菌的分离和鉴定，旨在探索土壤中酵母菌的生物多样性，并确定其优势酵母菌种。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

于2008年10月从河北省沙城酿酒葡萄产区的怀来县沙城镇葡萄园采集土样。2009年4月和10月分别于沙城镇所属沙营、夹河和东水泉3个自然村的龙眼葡萄园采集土样。采样方法是每个葡萄园按照三点采样法，每个采样点分别采集3个土壤样品，7个来源的土壤样品合计63份。

正向引物：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，反向引物：ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成；Taq DNA聚合酶、限制性内切酶cof I，HinfI，HaeIII均购自Promega公司。

1.2 培养基

YEPD液(固)体培养基(g/L)：酵母浸粉10、胰蛋白胨20、葡萄糖20、琼脂15，固体培养基可加入2%琼脂。

WL琼脂培养基(%)：酵母浸粉0.4、胰蛋白胨0.5、葡萄糖5、KH2PO40.055、KCl 0.0425、CaCl20.0125、MgSO40.0125、FeCl30.00025、MnSO40.00025、溴甲酚绿2.2、琼脂2，pH5.5[1-3]。

1.3 方法

1.3.1 土壤样品处理

称取1g土壤，置于20mL YEPD液体培养基中摇匀，28℃摇床富集培养12h，摇床转速180r/min，取1mL富集培养液作为分离菌种的样品。每份土壤样品富集培养两次作为平行实验。

1.3.2 酵母菌分离流程

无菌条件下取1mL含菌的富集培养液 → 用无菌生理盐水梯度稀释(10～107倍)→ 将合适梯度的稀释液涂布于YEPD固体培养基平板，28℃培养3d → 菌落计数 →随机选取不同形态的酵母单菌落15个，经多次划线培养，纯化单菌落 → 接种于 WL培养基平板，28℃培养5d后根据菌落形态和细胞的显微形态进行酵母菌的初步表型分类。

1.3.3 酵母菌DNA提取

酵母菌DNA的提取采用SDS裂解法[4]。

1.3.4 酵母菌PCR-RFLP分析

酵母菌5.8S-ITS rRNA 基因的扩增PCR反应体系及反应条件见参考文献[5-8]。采用3种限制性内切酶cofI、HaeIII和HinfI对PCR扩增产物进行酶切分析，反应体系及反应条件见参考文献[5]。

2 结果与分析

2.1 酵母菌形态的表型分类

利用YEPD培养基对葡萄园土壤样品进行菌种的分离，共分离得到210株酵母菌，经WL培养基培养，根据菌落形态和细胞的显微形态将其表型区分为9个不同的培养类型，结果见表1。

表1 酵母菌形态分类统计Table 1 Morphological features of yeast isolates

根据表1的结果，参考杨莹等[1]和Cavazza等[3]描述的酵母菌在WL培养基上的菌落特征, 可以推测出以上酵母菌可能的种属分类，类型4与文献[3]中描述的红色，球形突起，突面，表面光滑、黏稠，黄油状的酵母菌相似，推测其可能为红酵母(Rhodutorula)，类型6与文献[1,3]中描述的绿色，扁平，表面光滑不透明，黄油状的酵母菌相似，推测其可能为有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)，类型7为异常汉逊酵母(Hansenula anomala)，类型9与文献[1,3]中描述的奶油色带绿色球形突起，表面光滑、不透明，奶油状的酵母菌相似，推测其可能为酿酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)，类型1、2、3、5、8的酵母菌没有查到相关文献所匹配的菌落类型。由以上结果可以看出利用WL培养基虽然不能将全部酵母鉴定到种属水平，但是在酵母的形态分类方面具有较好的识别能力。

从表1还可看出，在不同年份、不同季节和不同地理位置的葡萄园中出现的酵母菌种类不同。2008年酿酒季节从沙营葡萄园土壤中分离得到2种形态的酵母菌，而在2009年的酿酒季节就得到了4种形态的酵母菌，在非酿酒季节的春季得到2种形态的酵母菌。夹河和东水泉葡萄园土壤中2009年春季分别分离到2种形态的酵母菌，都少于酿酒季节，2009年10月夹河和东水泉葡萄园土壤中分别分离到5种和3种形态的酵母菌。3次采样的结果为沙营龙眼葡萄园土壤共分离得到了6种形态的酵母菌，夹河和东水泉分别为6种和5种形态的酵母菌。在2009年春季3个葡萄园土壤中都分离到形态3酵母菌，2009年酿酒季节3个葡萄园土壤中都分离到形态2、6、9酵母菌。3个葡萄园均处沙城镇，相距不太远，土质和气候基本相似，均为沙石土壤、地域开阔、通风良好、光照充足。但是因地理位置不同，土质和微气候略有差异，东水泉是中粮酒业长城桑干酒庄所在地，土壤中含沙量高、砾石较大。夹河是“万亩葡萄示范园”所在地，葡萄园背靠大山位于西坡侧光，坡度约30～40度，海拔约50～100米。沙营和东水泉均为开阔的平地，但沙营的土质沙砾较小。

2.2 酵母菌群组成

本研究对分离得到的各种形态的酵母菌落进行了菌落计数和分析，不同地理位置的葡萄园、不同年份、不同季节采集的土壤样品，经过富集培养，培养液中酵母菌种类及各种酵母菌占总酵母菌数的百分比见表2。由此可以反映土壤中常见的酵母菌类型及分布情况。

由表2可看出，不同来源的土壤样品中酵母菌群组成各不相同，优势菌种的类型也不相同。2009年酿酒季节降雨少于2008年同期，2009年的气候更适合龙眼葡萄的生长，同期采集的葡萄成熟度高于2008年，含糖量高，故酵母菌种类也较丰富。春季采集的土壤样品中酵母菌落总数少于秋季，是由于该地区风沙较大、气温偏低，不适宜酵母菌的大量繁殖。在涉及到连续两个年份两个季节的3次采样中，只有形态2的酵母菌在3次采样中都分离到，形态1的酵母菌在连续两个酿酒季节出现，说明这两种酵母菌是沙营葡萄园土壤中最常见的酵母菌。

表2 不同采集地点的土壤富集培养液中酵母菌出现频率Table 2 Distribution of 9 classified yeast groups in the enrichment culture of vineyard soil

2.3 酵母菌5.8S-ITS基因RFLP分析

在形态表型分类的基础上，利用分子手段对酵母菌进行分类鉴定，根据核糖体5.8S rDNA-ITS区域的RFLP分析结果，得到了9种不同的酶切片段图谱，根据酶切产物片段大小的不同，将分离得到的酵母菌在分子水平上进行了区分，对比Guillamón等[9]和Esteve-Zarzoso等[10]学者建立的初始酵母菌数据库，将其中5种酵母进行了分类鉴定，结果见表3。

表3 土壤中酵母菌株5.8S rDNA-ITS区域的RFLP分析结果Table 3 RFLP analysis of 9 classified yeast groups

从表3可以看出，利用HaeIII、Hinf I和cof I这3种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，酶切片段大小范围为70～750bp，显示出这9种酵母菌株的基因多样性。将本实验中分离得到的9类酵母菌的酶切产物片段与数据库中模式菌株进行比对，能够鉴定出5类酵母菌，另外4类酵母菌需要进一步的研究，如比对数据更全的数据库(http://www.yeast-id.com/)，该数据库每年都在更新[10]。

由以上结果可知，通过对比数据库得到的鉴定结果与利用WL培养基得到的鉴定结果一致，说明WL培养基在鉴定酵母菌种类方面具有较高的准确性。

不同季节分离得到的酵母菌株，其PCR扩增图谱和酶切图谱分别见图1～3。

图1 2008年10月沙营、夹河、东水泉葡萄园土壤酵母菌5.8S-ITS区域PCR-RFLP图谱Fig.1 5.8S ITS RFLP patterns of yeast strains isolated from the soils from Shaying, Jiahe and Dongshuiquan vineyards in October, 2008

图2 2009年4月沙营、夹河、东水泉葡萄园土壤中酵母菌5.8S-ITS区域PCR-RFLP图谱Fig.2 5.8S ITS RFLP patterns of yeast strains isolated from the soils from Shaying, Jiahe and Dongshuiquan vineyards in April, 2009

图3 2009年10月沙营、夹河、东水泉葡萄园土壤中酵母菌5.8S-ITS区域PCR-RFLP图谱Fig.3 5.8S ITS RFLP patterns of yeast strains isolated from the soils from Shaying, Jiahe and Dongshuiquan vineyards in October, 2009

从以上电泳图能够看出，每种形态类型的酵母菌都对应一种独特的酶切图谱类型，在2009年10月，分离得到的酵母菌类型最丰富，有6种，而在2008年10月的土壤样品中只有两个不同类型的酵母菌。有些酵母菌在两个酿酒年份均可分离得到，并具有相同的电泳图谱类型，说明这些酵母菌可能来自于不同菌源，是该地区相对普遍存在的酵母菌种。

2.4 酵母菌5.8S-ITS基因序列分析

在以上研究结果的基础上，对于两个年份的酿酒季节都分离到的形态1和2酵母菌，以及在2009年出现在3个葡萄园中，相对出现频率较高的形态9酵母菌进行核糖体5.8S-ITS基因序列分析[9-11]，对这3种酵母菌5.8SITS基因RFLP的鉴定结果进行验证，结果见表4。

表4 酵母菌5.8S-ITS区域的基因序列分析结果Table 4 5.8S-ITS sequence analysis of three selected yeast stains

由表4可见，菌落类型1、2的酵母菌，其序列分析鉴定结果与酵母菌5.8S-ITS基因RFLP分析的鉴定结果完全一致，菌落类型9的酵母菌通过序列分析被进一步鉴定为酿酒酵母的杂交菌株(Saccharomyces bayanus× Saccharomyces cerevisiae)。序列分析的结果验证了5.8 SrDNA-ITS基因RFLP分析鉴定酵母菌种属的准确性。以上结果能够确定沙城产区龙眼葡萄园土壤中最常见的酵母菌种分别为东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)和热带假丝酵母(Candida tropicalis)。酿酒酵母(Saccharomyces bayanus×Saccharomyces cerevisiae)是2009年酿酒季节土壤中普遍存在的酵母菌。

3 讨 论

本实验在连续两年内对沙城产区三个龙眼葡萄园采集土壤样品进行菌种分离，对分离得到的酵母菌进行分类鉴定采用的是传统形态表型观察与分子鉴定相结合的方法，确保了分类鉴定结果的可靠性。实验最终确定了沙城产区龙眼葡萄园土壤中酵母菌的生物多样性组成，及常见的酵母菌种属。龙眼葡萄是原产于我国的特色优良酿酒和鲜食两用葡萄品种，适合于酿造干白葡萄酒、白兰地和起泡葡萄酒，在沙城地区有400年的种植历史，在该地区分离筛选酵母菌，研究它们的生物多样性对筛选和利用本土酵母菌并开发具有我国特色的葡萄酒产品具有实用价值。

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Biodiversity of Yeast in Soils from Longan Grape Plantations in Shacheng Region

LI Yan1,2，LU Jun1，ZHANG Li-zhong3
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China；3. China Great Wall Wine Co. Ltd., Shacheng 075400, China)

To isolate and screen characteristic yeast strains, 210 yeast strains were isolated from soils from three Longan grape plantations in Shacheng region by gradient dilution and streak plate methods. These stains were classified into nine groups according to their morphological phenotypes, and the nine groups were identified by 5.8S ITS restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, and two of them, Issatchenkia orientalis and Candida tropicalis, were common yeast strains. This study confirms the biodiversity of yeast in the oil of this region.

Longan vineyard；soil；yeast；morphological phenotypes RFLP method；biodiversity

TQ92

A

1002-6630(2010)19-0313-04

2010-05-31

河北省2009年科技支撑计划项目(092210003D)

李艳(1958—)，女，教授，本科，主要从事传统发酵工程创新技术研究。E-mail：lymdh5885@163.com