半巢式PCR法构建天然噬菌体单域重链抗体文库

涂 追，许 杨,*，何庆华，陶 勇

半巢式PCR法构建天然噬菌体单域重链抗体文库

涂 追1,2，许 杨1,2,*，何庆华1,2，陶 勇2

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学 中德联合研究院，江西 南昌 330047)

目的：构建天然噬菌体单域重链抗体文库，淘选可应用于食品安全检测的单域重链抗体。方法：以未经免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血为起始材料，提取RNA反转录为cDNA，根据重链抗体保守序列设计引物，通过半巢式PCR法扩增获得全套重链抗体可变区编码基因，将其克隆至噬菌粒pHEN1，电转化大肠杆菌TG1得到初级抗体库，辅助噬菌体KM13感染后得到噬菌体展示库。采用固相淘选法分别对3种人工抗原进行淘选。结果：单域重链抗体编码基因得到有效扩增，经10次电转化获得初级文库，命名为SNAL，实际库容量达到1.6×107个独立克隆，菌落PCR鉴定结果表明，克隆效率约为87%，辅助噬菌体救援后得到的展示文库命名为SNA-PDL，滴度达1013CFU/mL。对3种不同人工抗原DON-MBSA、NOR-BSA和AFB1-OVA的淘选均有富集现象。结论：构建了天然噬菌体单域重链抗体文库，文库的多样性较好，可以用于后续淘选。

单域重链抗体；VHH抗体；噬菌体文库；羊驼；半抗原

1993年，Hamers-Casterman等[1]报道在骆驼血清中大量存在一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体(heavychain antibodies，HCAbs)。克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体称为VHH抗体(variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)，其晶体结构为直径2.5nm、长4nm的圆柱体，也被称为纳米抗体(nanobody，Nb)[2]或单域重链抗体。

单域重链抗体分子质量小(约15kD)，具有易表达、高水溶性、耐高温、耐极度pH值等独特性质，有利于降低检测成本，缩短研发周期，目前已被广泛用于基础研究、医学诊断和检测、抗体药物开发等领域[3]。在食品安全检测领域，相关的研究和应用报道较少，已有的报道多为通过免疫动物，构建免疫文库，用于淘选针对特定抗原的单域重链抗体[4-5]。免疫库的优点是可以较为容易地筛选到针对免疫抗原的高亲和力抗体，但是构建免疫库需要较长时间免疫动物，如果抗原为有毒有害物质，可能对实验动物造成不良影响，而且某一特定的免疫库只能产生针对特定抗原的抗体，不能作为一个广泛应用的平台[6]。本研究采用噬菌体展示技术构建天然噬菌体单域重链抗体文库，以作为通用的技术平台，重复用于多种抗原的筛选，对3种小分子半抗原物质进行初步淘选，旨在为进一步开发基于单域重链抗体的检测方法和工具提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

淋巴细胞分离液(1.077) 上海生工生物工程服务有限公司；RNAiso、RT-PCR试剂盒、PrimeSTAR高保真DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA试剂盒 TaKaRa公司；T4连接酶 New England Biolab公司；酵母膏、蛋白胨 英国Oxoid公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

DON人工抗原(DON-MBSA)是将脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)与甲基化修饰牛血清白蛋白(MBSA)的共价偶联；诺氟沙星人工抗原(NOR-BSA)是将诺氟沙星(norfloxacin，NOR)与牛血清白蛋白(BSA)的共价偶联；黄曲霉毒素B1人工抗原(AFB1-OVA)是将黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)与卵清蛋白(OVA)的共价偶联。3种人工抗原均为实验室自制[7-9]。

1.1.2 淋巴细胞

采用真空采血管收集10mL健康羊驼外周血，用淋巴细胞分离液密度梯度离心收集单核细胞。

1.1.3 菌株及噬菌粒

大肠杆菌TG1、噬菌粒pHEN1和辅助噬菌体KM13由中国科学院上海生命科学研究院马维骏博士惠赠[10]。

1.1.4 引物

引物设计主要参考文献[11]并作适当修改，见表1。其中，AlpVh-LD位于抗体编码区的前导序列，AlpVh-SfiI位于可变区的框架区1(framework region 1，FR1)并在其5'端引入了Sfi I酶切位点及保护碱基，AlpVHHR1-NotI和AlpVHHR2-NotI分别位于两种重链抗体的铰链区(hinge region)，在5'端引入了Not I酶切位点及保护碱基。M13-R和pHEN-R两条引物为噬菌粒pHEN1的通用引物。

表1 文库构建及鉴定所用的引物Table 1 Primers used for library construction and characterization

1.2 方法

1.2.1 淋巴细胞的分离、总RNA的提取及反转录

将15mL枸橼酸抗凝的羊驼外周血以等体积磷酸缓冲液PBS(pH7.4)稀释，用1.077型淋巴细胞分离液分离收集淋巴细胞，800×g离心20min。参照RNAiso试剂说明书提取总RNA，以Oligo dT反转录获得cDNA，反应条件为42℃、30min，50℃、60min，72℃、15min。

1.2.2 VHH基因的扩增及其与载体的连接

采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，经半巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因。第一轮PCR分别以引物AlpVh-L和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-L和AlpVHHR2-NotI扩增cDNA，反应条件为：98℃、10s，50℃、20s，72℃、40s，35个循环，72℃延伸10min。将第一轮PCR产物稀释适当倍数后作为模板，分别用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI进行扩增，反应条件为：98℃、10s，50℃、20s，72℃、40s，5个循环，98℃、10s，68℃、40s，30个循环，72℃延伸10min。经DNA片段回收试剂盒回收、定量，于－20℃保存备用。将噬菌粒pHEN1和PCR扩增产物分别用Sfi I、Not I双酶切，经琼脂糖凝胶回收、定量后，分别以物质的量比1:1、1:3和1:5，16℃过夜连接。

1.2.3 噬菌体扩增、纯化和滴度测定

[12]进行。

1.2.4 噬菌体文库的构建

选择最佳的物质的量比，以总量1μg载体与PCR产物进行连接。连接产物经乙醇沉淀后，溶于10μL无菌水中，分10次进行电穿孔转化大肠杆菌TG1，感受态细胞的制备与转化参照文献[12]进行。取10μL电击、培养后的菌液倍比稀释，涂布氨苄青霉素2×YT(酵母膏蛋白胨培养基)培养板，计算库容。其余部分全部涂布于24cm × 24cm 氨苄青霉素2×YT培养板，37℃，倒置培养12～16h。用10mL，2×YT培养基将培养板上的菌苔刮洗后，加入终质量浓度15～30g/100mL甘油，分装，－80℃保存备用。

根据计算的库容量结果，接种10倍库容量的活细胞于5mL的2×YT(含2% 葡萄糖、100μg/mL 氨苄青霉素)培养基中，30℃，220r/min培养至OD600nm达0.5，按感染复数20:1加入辅助噬菌体，37℃、220r/min培养60min。将培养物在3000×g离心10min，用50mL的2×YT(含100μg/mL 氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素) 培养液重悬沉淀，30℃、220r/min过夜培养后，3000×g离心取上清，按标准方法纯化噬菌体[9]，即得到噬菌体抗体文库，取10μL测定滴度，其余分装于－80℃保存备用。

1.2.5 文库的鉴定

随机挑取40个克隆进行分析，利用载体上的通用引物(M13-R和pHEN-R)进行PCR验证。

1.2.6 噬菌体文库初步淘选

用PBS稀释抗原至50～100μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜，吸出包被液，PBS洗板3次，3% BSAPBS在37℃封闭2h，PBS洗板3次，加入噬菌体抗体库100μL(约含2×1011CFU)，37℃孵育1.5h，用PBST (含0.5%吐温-20)洗板3次(逐轮增加1次)，再用TBS (Tris-buffered saline)缓冲液洗板10次(逐轮增加5次)。以100μL洗脱液(甘氨酸-盐酸，pH2.2)洗脱吸附在酶标孔中的噬菌体，用50μL Tris-HCl(1mol/L，pH8.0)中和洗脱物，取10μL用于滴度测定，其余洗脱物扩增后用于下一轮淘选。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取与分析

图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA

经血球计数板计数，从羊驼外周血收集到约3×107单个核细胞。紫外分光度法测定提取总RNA的OD260nm/ OD280nm=2.0，表明提取的总RNA没有明显的蛋白质等有机物污染，根据OD260nm值计算，共提取总RNA约30μg。

图1显示，28S rRNA和18S rRNA两条带清晰，经Quantity One 4.6.1生物图像分析系统(Bio-Rad)分析，28S rRNA条带的亮度为18S rRNA条带亮度的1.9倍，表明总RNA分子完整、无降解。

2.2 全套可变区基因的获取

分别用0.5、2.5、5μL总RNA进行反转录合成cDNA，混合后作为PCR的模板，用针对短铰链区和长铰链区的引物分别扩增两种不同亚群的单域重链抗体可变区。第一轮PCR扩增获得了在500～1000bp范围内的弥散条带(图2)，预期第一轮扩增产物(应为在500bp左右的弥散条带)在此范围内。

图2 第一轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the first-round PCR products

取10μL回收后的第一轮PCR产物，稀释10、100、1000、10000倍后，分别取1μL作为第二轮PCR的模板，结果显示，当模板稀释10倍时所获得的目的产物(约500bp)量较多(图3，泳道1)，故以稀释10倍的第一轮产物为模板进行大量的PCR扩增。第二轮PCR扩增获得了450bp 左右的弥散条带(图4，箭头所示)，与预期相符。

图3 第二轮PCR模板量优化Fig.3 Optimization of template for the second-round PCR

图5 菌落PCR鉴定初级文库SNALFig.5 PCR analysis of colonies randomly picked from SNAL

表2 三种抗原淘选结果Table 2 Results of library panning with DON-MBSA, NOR-BSA and AFB1-OV

图4 第二轮PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis of the second-round PCR products

2.3 连接与电转化

将第二轮PCR产物酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收450bp左右条带，与噬菌粒连接。当连接体系中外源片段和噬菌粒载体的物质的量比为3:1时，电转化后得到的菌落数最多，以此比率进行大规模连接。经10次电转化获得了初级文库，命名为SNAL，菌落计数测定结果显示初级文库容量达到2×107个独立克隆。

2.4 文库鉴定

选择50～200个单菌落的SNAL文库菌落计数平板，随机挑取40个菌落进行菌落PCR鉴定克隆效率，由电泳结果可见，阳性对照能扩增出条带，阴性对照未见条带，说明PCR鉴定结果可靠，在40个克隆中有35个能扩增出400～750bp条带(图5)，提示初级文库SNAL的克隆效率约为87%，因此该初级文库的实际库容为1.6× 107个(其中包含冗余序列，串联序列以及无义突变序列等无效克隆)。

2.5 文库的淘选

分别以3种人工抗原DON-MBSA、NOR-BSA和AFB1-OVA为配基，对文库进行淘选，结果显示，噬菌体回收率逐轮提高，对于3种人工抗原都存在不同程度的富集(表2)，提示文库具有较好的多样性。

3 讨 论

单域重链抗体文库的构建早期是以骆驼属(Camelus sp.)动物为来源[13]。近年来，有报道以羊驼属(Lama sp.)动物为来源，构建特异性单域重链抗体免疫库[14]。与骆驼属动物相比，羊驼(Lama pacos)体型较小，易于获得和饲养。

在羊驼的血液中，天然存在3种免疫球蛋白IgG1、IgG2和IgG3，它们的物质的量比大致为50:30:20[11]，其中IgG2和IgG3是缺失轻链的重链抗体，IgG2是具有长铰链区的重链抗体，IgG3是具有短铰链区的重链抗体。本研究根据羊驼单域重链抗体的保守序列，设计了两套引物分别扩增IgG2和IgG3的可变区，更有利于获得全部的重链抗体可变区基因。

重链抗体可变区具有较长的CDR3区，而且不同的抗体长度差异较大[15]，因此最终的扩增产物应为一定大小范围的DNA片段，而不是一条特异性扩增条带。为了尽可能扩增出所有的抗体序列，在进行第一轮PCR反应的过程中，采用了较低的退火温度(50℃)，产生了大量非特异性扩增产物(图3)，在第二轮PCR反应过程中，为了增加特异性，采用了两步法扩增反应，并对模板浓度进行了优化从而得到大量目的产物(约450bp，图4)。对文库菌落PCR分析结果显示，文库SNAL中克隆的外源DNA片段大小在240～500bp之间(大多数为400bp左右，图5)，表明该文库中存在一些非特异性PCR扩增产物。可以通过改变PCR反应条件和缩小割胶回收范围提高文库中目的编码序列的比率，但是会增加丢失抗体编码基因的风险[16]。

噬菌体抗体库技术结合了PCR技术和噬菌体展示技术，将特定抗体分子的基因型和表型统一在同一噬菌体内，便于获取所需特定抗体的编码基因[17]。天然抗体库采用未经主动免疫的健康个体样本，对于特定的抗原没有偏向性，理论上可克隆出巨大数量的抗体，以结合多种多样的抗原[18]。实际上抗体库的容量和多样性与获得特定抗体的亲和力和种类成正相关[19-20]。本研究用噬菌体文库SNA-PDL对3种不同的人工抗原进行淘选，结果表明对3种人工抗原均有明显的富集现象，说明文库中存在能够特异性结合这3种人工抗原的噬菌体颗粒，初步验证了文库的多样性，有望获得针对这3种小分子半抗原的单域重链抗体，为进一步建立相应的检测方法提供物质和技术基础。

与单链抗体(single-chain variable fragment，ScFv)、抗原结合片段(fragment of antigen-binding，Fab)等小分子抗体库相比，单域重链抗体库具有更多的优势。通过PCR技术可以直接获得完整的单域重链抗体编码基因，简化了文库构建步骤，抗体分子片段小，有利于构建大容量抗体库，易于在大肠杆菌中表达[21]。

参考文献：

[1]HAMERS-CASTERMAN C, ATARHOUCH T, MUYLDERMANS S, et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains[J]. Nature, 1993, 363(6428): 446-448.

[2]MUYLDERMANS S, BARAL T N, CORTEZ RETAMOZZO V, et al. Camelid immunoglobulins and nanobody technology[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2009, 128(1/3): 178-183.

[3]杨珂, 王冬. 纳米抗体及其应用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2008, 24(4): 425-427.

[4]DOYLE P J, ARBABI-GHAHROUDI M, GAUDITTE N, et al. Cloning, expression, and characterization of a single-domain antibody fragment with affinity for 15-acetyl-deoxynivalenol[J]. Molecular Immunology, 2008, 45(14): 3703-3713.

[5]LADENSON R C, CRIMMINS D L, LANDT Y, et al. Isolation and characterization of a thermally stable recombinant anti-caffeine heavychain antibody fragment[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(13): 4501-4508.

[6]秦思远，董关木. 噬菌体展示抗体库技术的研究进展[J]. 中国生物制品学杂志, 2009, 22(2): 201-204.

[7]邓舜洲, 游淑珠, 许杨. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原的研制[J]. 食品科学, 2007, 28(2): 149-152.

[8]于海峰, 谭建华, 孙靖, 等. 诺氟沙星人工抗原的合成[J]. 吉林农业大学学报, 2007, 29(4): 443-446.

[9]江湖, 熊勇华, 许杨, 等. EDC法制备黄曲霉毒素B1人工抗原的研究[J]. 食品科学, 2005, 26(7): 125-128.

[10]孔波, 刘惠, 杨胜利, 等. 大分子量重组蛋白在丝状噬菌体表面的展示表达及其与小分子相互作用的初步研究[J]. 生物工程学报, 2006, 22(1): 19-25.

[11]MAASS D R, SEPULVEDA J, PERNTHANER A, et al. Alpaca(Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs)[J]. Journal of Immunological Methods, 2007, 324(1/ 2): 13-25.

[12]SAMBROOK J, RUSSELL D W. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

[13]GHAHROUDI M A, DESMYTER A, WYNS L, et al. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavychain antibodies[J]. Febs Letters, 1997, 414(3): 521-526.

[14]van der LINDEN R, de GEUS B, STOK W, et al. Induction of immune responses and molecular cloning of the heavy chain antibody repertoire of Lama glama[J]. Journal of Immunological Methods, 2000, 240(1/2): 185-195.

[15]VU K B, GHAHROUDI M A, WYNS L, et al. Comparison of llama V-H sequences from conventional and heavy chain antibodies[J]. Molecular Immunology, 1997, 34(16/17): 1121-1131.

[16]MARKS J D, TRISTEM M, KARPAS A, et al. Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotide probes [J]. European Journal of Immunology, 1991, 21(4): 985-991.

[17]CLACKSON T, LOWMAN H B. 噬菌体展示: 通用实验指南[M]. 马岚, 卢帅, 李铭, 译. 北京: 化学工业出版社, 2008.

[18]秦思远, 董关木. 噬菌体展示抗体库技术的研究进展[J]. 中国生物制品学杂志, 2009, 22(2): 201-204.

[19]毛晓燕, 乔玉玲, 卢卫嘉, 等. 人源天然ScFv噬菌体抗体库的构建及鉴定[J]. 中国生物工程杂志, 2010, 30(5): 18-22.

[20]王琰. 基因工程抗体研究进展[J]. 中国免疫学杂志, 1999, 15(5): 193-195.

[21]崔华清, 王清明. 基于重链抗体构建的单域抗体研究进展[J]. 生物工程学报, 2005, 21(3): 497-510.

Construction of Alpaca-derived Naive Single-domain Antibody Phage Display Library by Semi-nested PCR

TU Zhui1,2，XU Yang1,2,*，HE Qing-hua1,2，TAO Yong2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Objective: To construct a single-domain heavy chain antibody phage display library for food safety detection. Methods: Total RNA was purified from peripheral lymphocytes of two healthy non-immune alpaca (Lama pacos) and directly used for complementary DNA (cDNA) synthesis. The repertoire of VHH encoding DNAs was amplified by semi-nested PCR, and the PCR products were cloned into the phagemid vector pHEN1. Through the electroporation of E. coli TG1, a primary library was established and then rescued by the helper phage KM13 to generate a phage display library. The generated phage display library was used to pan three different artificial antigens by solid phage biopanning. Results: The VHH encoding DNAs was amplified. After electroporating for 10 times, the primary library named as SNAL was generated containing more than 107independent clones. The cloning efficiency was up to 87%. The titter of the phage display library obtained after the rescue with KM13 named as SNA-PDL was up to 1013CFU/mL. All antigen screening data exhibited a significant enrichment in phage particles. Conclusion: A naive single-domain antibody phage display library has been successfully constructed. This library exhibits good diversity and can be used to the recovery of binders.

single-domain heavy chain antibody；VHHs；phage display library；alpaca；hapten

Q789

A

1002-6630(2010)19-0299-05

2010-06-30

国家中小企业创新基金项目(09C26213604449)；江西省教育厅青年科学基金项目(GJJ09442)；江西省自然科学基金项目

涂追(1982—)，男，博士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：tuzhui@yahoo.com.cn

*通信作者：许杨(1951—)，女，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：xuyang1951@yahoo.com.cn