滇姜花二萜成分的抗肿瘤活性研究

赵 庆,贺小琼,郝小江,邹 澄＊

1云南中医学院中药学院,昆明 650200;2中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室,昆明 650204;3昆明医学院药学院,昆明 650031

滇姜花二萜成分的抗肿瘤活性研究

赵 庆1,2,贺小琼3,郝小江2,邹 澄3＊

1云南中医学院中药学院,昆明 650200;2中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室,昆明 650204;3昆明医学院药学院,昆明 650031

对滇姜花粗提物、滇姜花素A(1)和姜花酮(2)进行了动物体内抗肿瘤活性测试,结果表明它们均能显著性抑制小鼠体内移植性肿瘤 H22的生长,其中滇姜花素 A对小鼠 H22肿瘤生长抑制率达 54.27%,作用最强。体外抗肿瘤实验发现,滇姜花素 C(3)对体外培养的人类乳腺癌细胞株MDA-MB-231具有较强的细胞毒作用,并具有明显的剂量效应关系。

滇姜花;滇姜花素A;滇姜花素 C;姜花酮;抗肿瘤活性

国内外已对姜科姜花属植物抗肿瘤活性二萜成分进行了一些研究。日本学者曾从姜花属植物姜花中分离得个数个对 V-79细胞具有体外抗肿瘤活性的成分[1]。我们曾对姜花属植物滇姜花和圆瓣姜花根茎的化学成分进行了研究,分离得到了多个萜类成分[2-7];并对一部分二萜成分进行了对 KB细胞的细胞毒活性筛选,大部分被筛选的成分显示有活性,其中二萜成分滇姜花素B、C对 KB细胞的细胞毒活性十分显著[3,4]。此后我们又从圆瓣姜花中分离得到了数个二萜成分,其中部分二萜成分对 K-562细胞和A-549细胞显示了显著的体外细胞毒活性[6]。到目前为止,对姜花属二萜成分的抗肿瘤活性研究仅仅局限于体外抗肿瘤实验,尚未见到有关体内抗肿瘤活性的研究报道。因此,我们十分关注姜花属二萜成分是否具有体内抗肿瘤活性,并开展了相关的研究工作。

1 材料与方法

1.1 样品制备

滇姜花根茎样品采于云南省昆明市,植物标本由中国科学院昆明植物研究所童绍全研究员鉴定为Hedychium yunnanense Gangep.,保存于中国科学院昆明植物研究所植物化学实验室。

取滇姜花根茎样品 14 kg用 95%乙醇回流提取三次。乙醇提取物依次用石油醚提取三次,乙酸乙酯提取一次,正丁醇提取三次。石油醚提取部分共805 g,取其中 500 g经硅胶柱层析、石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,其中的石油醚-乙酸乙酯(40:1)洗脱部分再经氧化铝柱层析、石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,得到姜花酮 (1)14 g,滇姜花素A(2)3.2 g。石油醚-乙酸乙酯(2:1)洗脱部分再经硅胶柱层析、氯仿-甲醇 (80:1)洗脱,得滇姜花素 C(3)210 mg。上述三个化合物经核磁共振法测试为纯品,纯度均在 95%以上。另取 200 g滇姜花根茎样品用 95%乙醇回流提取三次,提取液浓缩后得滇姜花粗提物 12 g。

图 1 化合物 1～3的化学结构Fig.1 Structures of compound 1-3

在小鼠体内抗肿瘤实验中,滇姜花粗提物、滇姜花素A和姜花酮以二甲基亚砜(DMSO)溶解进行实验,使用剂量分别为 100、50、50 mg/kg。在体外细胞培养抗肿瘤实验中,滇姜花素 C以 DMSO溶解,使用浓度分别为 0、2.5、5.0、10.0μg/mL。

1.2 小鼠体内抗肿瘤实验

清洁级 ICR小鼠共 50只,雌雄各半,体重 19～21 g,由云南白药股份集团有限公司提供 (滇实动证2002106,编号 0000057)。将小鼠随机分为 5组,分别为阴性对照组、阳性对照组、滇姜花素 A组、姜花酮组和滇姜花粗提物组,每组 10只小鼠,雌雄各半。小鼠在适应性喂养 2 d后,于右前肢皮下接种新鲜的 H22肿瘤细胞悬液 (0.1 mL/鼠,1×106细胞), H22细胞株由云南省肿瘤研究所提供。在接种肿瘤细胞后的第 2日开始按分组给药。阴性对照组腹腔注射给予DMSO,阳性对照组给予环磷酰胺,其它各组给予相应的待测物。每天给药 1次,于给药的第7 d将动物脱臼处死,完整剥离肿瘤并在电子称称肿瘤重量及肿瘤剥离后的动物体重。比较分析各组肿瘤重量及瘤重抑制率。

瘤重抑制率 (%)=(阴性对照组肿瘤平均重量 /g-样品组肿瘤平均重量 /g)/阴性对照组平均肿瘤重量/g×100%

1.3 体外抗肿瘤活性

MDA-MB-231是美国国立癌症研究所推荐的抗肿瘤药物筛选的癌细胞株之一,是雌激素受体阴性的人类乳腺癌细胞株,是乳腺癌研究中常用细胞株,并能在裸鼠体内进行普通接种。本次采用 MDAMB-231进行实验,不仅能观察体外抗癌效果,并能为以后的裸鼠体内抗癌实验提供参考依据。MDAMB-231细胞株由美国 ATCC公司提供。将培养的肿瘤细胞接种于 6孔板,于 37℃、5%CO2培养箱培养 24 h后,吸去培养液,用 PBS洗一遍,再加入含有不同浓度待测物滇姜花素 C的培养液,每个剂量同时做 3孔平行检测。加样培养 72 h后收集细胞,于显微镜下计数癌细胞数,统计分析结果并绘制细胞增殖抑制曲线。

细胞增殖抑制率 (%)=(阴性对照组细胞数-待测物组细胞数)/阴性对照组细胞数 ×100%

1.4 统计方法

小鼠的体重、瘤重和体外癌细胞均数采用 t检验进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 滇姜花粗提物、滇姜花素 A及姜花酮对小鼠体内 H22肿瘤生长的抑制活性

体内抗肿瘤实验研究结果见表 1。

表 1 体内抗肿瘤实验研究结果Table 1 Result of thein vivoanticancer activity

肿瘤生长研究结果表明,滇姜花粗提物、滇姜花素A和姜花酮均显示了明显的体内抑瘤活性,其中滇姜花素A、姜花粗提物的体内抑瘤活性很强,肿瘤生长抑制率超过了环磷酰胺阳性对照组,姜花酮的抑瘤活性最低。

表 1结果还显示,三个给药组动物体重增长缓慢,尽管结果比较未发现各组之间体重有显著性差异,但各给药组动物的平均体重都低于阴性对照组,说明滇姜花粗提物、滇姜花素 A和姜花酮在本研究的使用剂量下可能有一定毒性。

2.2 滇姜花素 C对人类乳腺癌细胞株MDA-MB-231的体外细胞毒活性

滇姜花素C对人类乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的体外细胞毒活性,结果见表 2和图 2。

表 2 滇姜花素 C对MDA-MB-231乳腺癌细胞株的抑制率Table 2 Inhibitory rate of yunnancoronarin C against human breast cancer cell lineMDA-MB-231in vitro

图 2 滇姜花素 C对MDA-MB-231乳腺癌细胞株的抑制率曲线Fig.2 Inhibitory curve of yunnancoronarin C against human breast cancer cell lineMDA-MB-231in vitro

结果表明,滇姜花素 C对MDA-MB-231乳腺癌细胞株具有很较强的抑制作用,并具有很好的剂量反应关系,其 IC50＜5μg/mL。在剂量为 10μg/mL时,抑制率可达 100%。该实验结果具有较好的重现性。

3 讨论

滇姜花 (Hedychium yunnanense Gangep.)为姜花属植物,主产于云南。滇姜花中含量最高的二萜成分为姜花酮 (hedychenone,1)与滇姜花素 A(yunnancoronarin A,2),在过去的研究工作中,这两个二萜成分均具有体外抗肿瘤活性。本次研究结果表明,滇姜花素A、滇姜花的粗提物和姜花酮对小鼠体内移植性肿瘤均具有显著的抗肿瘤活性,其中以滇姜花素A的作用最强。体外的抗肿瘤实验结果显示,滇姜花素 C对人类的肿瘤细胞株具有较强的细胞毒作用,与前期的体外细胞毒作用研究[4]一致。已经取得的研究结果表明,滇姜花中的二萜成分在体内体外对动物肿瘤细胞株和人类肿瘤细胞株均有很好的抗肿瘤活性,值得作为抗肿瘤药物进行进一步研究。

本次在动物体内抗肿瘤实验中也发现,滇姜花提取物对动物的体重生长有明显影响,在本次实验剂量下,实验组动物体重生长缓慢且出现了一定的毒性反应。因此,在今后的研究中,应该对其进行安全性毒理学评价,了解其毒性作用。滇姜花的二萜成分的体内体外抗肿瘤作用机制将在今后的研究中进行探讨。

1 Itokawa H,Morita H,Katou I,et al.Cytotoxic diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium.Planta M edica, 1988,54:311-315.

2 Zhao Q(赵庆),Hao XJ(郝小江),Chen YZ(陈耀祖),et al.Studies on diterpenoid constituents of Hedychium yunnanense.Chem J Chin Univ(高等学校化学学报),1995, 16:64-68.

3 Zhao Q(赵庆),Hao XJ(郝小江),Chen YZ(陈耀祖),et al.Studies on diterpenoids fromHedychium forrestiiand their antitumor activity.Acta Phar m Sinica(药学学报),1995, 30:119-122.

4 Zhao Q(赵庆),Hao XJ(郝小江),Chen YZ(陈耀祖),et al.Antitumor diterpenoids fromHedychium yunnanenseand their photosensitized oxidation.Acta Botanica Sinica(植物学报),1999,41:528-530.

5 Zhao Q(赵庆),Hao XJ(郝小江),Zou C(邹澄),et al.Two new components fromHedychium yunnanense.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发),2008,20:761-764.

6 Zhao Q(赵庆),Qing C(卿晨),Hao XJ(郝小江),et al. Cytotoxicity of labdane-type diterpenoids fromHedychium forrestii.Chem Phar m Bull,2008,56:210-212.

7 Zhao Q(赵庆),Hao XJ(郝小江),Zou C(邹澄),et al. Norditerpenoids fromHedychium villosum.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发),2009,21:10-12.

Anticancer Effect of D iterpenes from Hedychium yunnanense

ZHAO Qing1,2,HE Xiao-qiong3,HAO Xiao-jiang2,ZOU Cheng3＊

1Faculty of Phar macy,Yunnan Traditional ChineseM edical College,Kunm ing 650200,China;2State Key Laboratory of Phytochem istry and Plant Resources in W est China,Kunm ing Institute of Botany,Chinese Academ y of Sciences, Kunm ing 650204,China;3School of Phar maceutical Sciences,Kunm ing M edical University,Kunm ing 650031,China

Thein vivoanticancer activity of yunnancoronarin A(1),hecychenone(2),and crude extract of hedychium yunnanense was tested here.Result revealed that yunnancoronarin A,hecychenone and the crude extractl showed significant inhibitory effecton H22 tumor in ICR mice.YunnancoronarinA had the strongest inhibitory effect,with the inhibitory ratio of 54.27%.Yunnancoronarin C(3)also showed strong anticancer effecton human breast cancer cell lineMDAMB-231 in vitro.

Hedychium yunnanense;yunnancoronarin A;yunnancoronarin C;hedychenone;anticancer activity

?

R285;Q946

A

1001-6880(2010)03-0395-03

2009-04-02 接受日期:2009-07-31

云南中医学院科学研究基金项目 (2007年重点项目);云南省应用基础研究计划面上项目(2006C0045)

＊通讯作者 Tel:86-871-5729436;E-mail:qingzhaoyn2008@126.com