CD4+CD25highTr和CTLA-4与炎症性肠病的关系研究

顾 危页,庞 智,郑家驹,沈必武,周春立,皇甫照

(江苏省苏州市立医院北区消化内科,江苏苏州,215008)

CD4+CD25high调节性T细胞(CD4+CD25highTr)被认为是一组具有免疫平衡调节性功能的T细胞亚群,在维持机体自身免疫耐受过程中具有十分重要作用[1]。已有众多研究表明,T细胞功能紊乱是炎症性肠病(IBD)发病的一个重要因素[2]。虽然已有CD4+CD25highTr在IBD或克罗恩病(CD)或溃疡性结肠炎(UC)患者中变化的研究报道[3-6],但国内尚未有同时对CD4+CD25high Tr与CT LA-4在CD与UC中的变化进行研究的报道。为此,作者对CD与UC患者同时进行了CD4+CD25highT r的水平和CTLA-4水平进行了初步研究,探讨其在IBD中的可能作用与意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

50例IBD患者(其中UC患者20例,CD患者30例)。均为 2008年 1月～2009年12月在我院门诊就诊或住院患者,其中男30例,女20例,年龄22～58岁,平均(37±6.3)岁。其诊断均符合2001年我国制定的《对炎症性肠病诊断治疗规范的建议》[7]中的诊断标准。IBD组患者近1个月未使用皮质激素治疗,近3个月未使用过免疫抑制剂。对照组为年龄与性别匹配的体检健康者29例,年龄26～55岁,平均(38±8.5)岁。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器:CD4+CD25highTr鉴定采用藻红蛋白(PE)结合的CD25-PE单克隆抗体和异硫氰酸萤光素(FITC)标记的CD4-FITC单克隆抗体,阴性对照为IgG2a-FITC和IgG1-PE;CD4+T细胞的鉴定分别采用CD4-FITC单克隆抗体,上述试剂均为美国BD公司产品。PE-CTLA-4配套染色试剂均购自eBioscience公司。流式细胞仪使用美国BD公司FACS Aria型。

1.2.2 人外周血单个细胞核细胞(PBMC)分离:采集3 mL静脉血,EDTA抗凝。Hank′s液等体积稀释,用 Ficoll液进行密度梯度离心(1 000 rpm,20 min),获取PBMC,充分洗涤后用RPMI 1640完全培养液调整PBMCs浓度为2×106/mL。

1.2.3 CD4+CD25highTr和CD4+细胞的检测:取上述制备好的细胞悬液100 μ L,分别加入荧光标记的单克隆抗体CD3、CD4、CD25各 10 μ L,4 ℃闭光孵育30 min。以PBS(磷酸盐缓冲溶液)洗涤2次、离心1 500 rpm,8 min,上流式细胞仪先后检测CD4+CD25highTr和CD4+T细胞,BD FACS专用FACSDIVA软件分析。CD4+CD25highTr:以CD4-SS设门,分析门内CD4+CD25highT r细胞亚群,每份标本计数5 000个CD4+T细胞,结果以CD4+CD25highTr细胞占CD4T细胞的百分率表示。CD4T细胞:重复上述步骤,结果以CD4+T细胞占CD3+T细胞的百分率表示。

1.2.4 CTLA-4的染色:将待测细胞用PBS洗涤2次后,加入1 mL细胞固定液,室温固定7 min,PBS洗涤2次后加入200 μ L含有通透剂的缓冲液作用2 h,然后加入特异性的PE标记的抗CTLA-4单克隆抗体,4℃闭光反应30 min,洗涤2次,300 μ L染色缓冲液重悬细胞,应用流式细胞仪检测,BDFACS专用FACSDIVA软件分析,结果以CTLA-4阳性细胞占CD4+T细胞的百分率表示。

1.3 统计学处理

2 结 果

CD组、UC组与健康对照组比较,结果见表1。

表1 IBD患者与健康对照者的结果比较

3 讨 论

IBD包括CD与UC在内的病因及发病机制均未阐明。众多研究认为IBD可能系过度的T辅助性细胞(Th)反应所致。现已了解,CD与UC分别均由CD4+T细胞(Th细胞)分化的Th1细胞或Th2细胞所介导[8]。

近年来研究发现[3-6],机体内存在的天然CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cell,Tregs)具有极强的免疫调节功能,可能是介导机体主动免疫耐受的主要细胞。CD4+CD25+Treg细胞通过分泌产生抗炎细胞因子IL-10和TGF-β发挥其免疫抑制效应,阻止和下调CD4+CD25+Treg细胞导致促炎性反应。CD4+CD25+Treg作为一组独立功能的T细胞亚群,在免疫抑制机制和维持自身免疫耐受过程中起着重要作用。CD4+CD25+Treg细胞占外周血CD4+T细胞的5%～10%,但具有免疫调节或免疫抑制活性的细胞主要是高表达CD25+的CD4+T细胞,即CD4+CD25high调节性T细胞[9](CD4+CD25highTr)。CD4+CD25highTr细胞数量的减少、表面分子表达的缺陷、抑制功能的受损,都与IBD的发生相关。CD4+CD25highTr细胞通过分泌产生抗炎细胞因子IL-10和TGF-β发挥其免疫抑制效应,阻止和下调CD4+CD25highTr导致促炎性反应。

另一方面,细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)(又称CD152)与炎症性疾病的关系已引起广泛关注[10]。由于CTLA-4是T细胞激活的重要调节因子,CT LA-4是T细胞表面重要膜分子,CD4+CD25highTr细胞活化后CTLA-4的表达增加,并持续表达。CD4+CD25+Tr细胞的调节活性,有赖于CTLA-4分子的表达。它是一种抑制性调节调节分子,很可能CD4+CD25highTr细胞是通过CTLA-4接受信号而被赋予了无应答表型和抑制功能。用抗CTLA-4单抗可阻断 CD4+CD25highT r细胞的抑制作用。用同种异体细胞包被抗CTLA-4抗体增加CD4+CD25CTLA-4细胞数量,能抑制炎症前因子IFN-γ和IL-2D的产生,上调IL-10、TGF-β及 IL-4。CD4+CD25+T 淋巴细胞和CD4+CD25-T淋巴细胞的共同培养体系中加入抗CTLA-4单抗可以明显减轻前者对后者的抑制作用,而给予正常小鼠注射抗CTLA-4单抗或(和)抗CD25单抗则会出现一些免疫相关性疾病。提示CTLA-4可能在CD4+CD25+T细胞的分化或免疫抑制作用中发挥一定作用[11]。

本研究显示,IBD患者外周血CD4+水平与对照组比较无明显差异,外周血CD4+CD25highTr细胞及CT LA-4与IBD关系密切。IBD患者外周血CD4+CD25highTr细胞的比例明显降低,说明调节性T细胞在病变时以CD4+CD25high水平下降为主,同时CT LA-4水平也明显下降,提示 IBD患者的免疫异常与CD4+CD25highTr细胞下降和CTLA-4水平明显下降密切相关。而CD4+CD25highTr细胞下降可能与CTLA-4水平密切相关。

综上所述,本研究提示了CD4+CD25highTr、CTLA4等在IBD发生发展中起着重要作用,为进一步揭示IBD的发病发展的机制提供了重要依据与线索。深入研究 IBD患者CD4+CD25highTr细胞与CTLA4相互关联,对于阐明IBD的发病机理及探索新的免疫治疗途径,具有重要的临床意义。

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