雌激素与山核桃油干预对去卵巢大鼠海马早老基因-1与载脂蛋白E基因表达的影响

陈默然，张 巍，沈 楠，赵行宇

(1.吉林医药学院 科研处， 吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院生化教研室， 吉林 吉林 132013；3.吉林医药学院实验中心， 吉林 吉林 132013；4.吉林医药学院心理教研室， 吉林 吉林 132013)

雌激素与山核桃油干预对去卵巢大鼠海马早老基因-1与载脂蛋白E基因表达的影响

陈默然1，张 巍2，沈 楠3，赵行宇4,*

(1.吉林医药学院 科研处， 吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院生化教研室， 吉林 吉林 132013；3.吉林医药学院实验中心， 吉林 吉林 132013；4.吉林医药学院心理教研室， 吉林 吉林 132013)

目的：观察雌激素干预后，核桃油对去卵巢大鼠海马组织早老基因-1(PS-1)与载脂蛋白E(aproE)基因表达及匀浆液中β淀粉样肽(Aβ)含量的变化。探讨核桃油对PS-1、aproE表达的调节与雌激素(E2)间的关系。方法：以去卵巢雌性大鼠为动物模型，实验组灌胃给予核桃油100mg/(kg bw·d)(低剂量组)、200mg/(kg bw·d)(中剂量组)、400mg/(kg bw·d) (高剂量组) (n=16)。空白组给予相同剂量的生理盐水。各组一半的大鼠随机接受E2处理，采用RT-PCR检测大鼠海马PS-1与aproE基因表达，RIA检测海马Aβ的含量的变化，放免法测血清E2水平。结果：雌激素干预的模型鼠血清E2水平显著高予未干预组(P＜0.01)；海马Aβ含量空白组最高，随核桃油剂量增加Aβ含量逐渐下降，中、高剂量组更显著(P＜0.05)，E2干预后Aβ含量下降更明显；空白组PS-1的表达最高而apoE的表达最低，随核桃油剂量增加各剂量组PS-1的表达仅轻度下降，apoE-mRNA表达明显增加；雌激素干预后PS-1的表达有所下降，apoE基因各组间表达差异消失。结论：E2和核桃油都可以通过降低去卵巢大鼠海马的PS-1基因及增加aproE基因的表达来降低Aβ的水平；但二者对PS-1基因调节可能通过不同的途径实现，而对apoE基因可能通过相同的途径来调节。

RT-PCR；PS-1；apoE；Aβ；去卵巢大鼠

Abstract：Objective: To study the effect of pecan oil on the serum estrogen (E2) level and gene expressions of Alzheimer gene -1 (PS-1) and apolipoprotein E (aproE) gene and Aβ content in the hippocampus of ovariectomized rats subjected to E2 intervention.Methods: Ovariectomized female rats were used as animal model and divided into 8 groups for 8 rats in each group: groups given low dose (100 mg/kg) pecan oil alone or plus E2, separately named low-dose pecan oil group and low-dose pecan oil plus E2 group,middle-dose pecan oil group and middle-dose pecan oil plus E2 group and high-dose pecan oil group and high-dose pecan oil plus E2group obtained similarly, control group (given only saline) and E2 group (given only E2). RT-PCR was used to detect the gene expressions of PS-1 and aproE in rat hippocampus, and radioimmunoassay to detect the level of Aβ in rat hippocampal and serum E2 level. Results: E2 intervention resulted in a significant (P＜0.01) increase in serum E2 level in ovariectomized rats. The highest Aβ level was observed in the control group. Regardless of whether or not E2 intervention was adopted, Aβ level gradually decreased with increasing pecan oil dosage and a significant difference (P＜0.05) was observed within both middle and high dose groups. The presence of E2 resulted in a large decrease in Aβ level in comparison with the control group, which exhibited the highest PS-1 gene expression but the lowest aproE gene expression. For rats both with and without E2 intervention, PS-1 geneexpression showed only a slight decrease with increasing pecan oil dosage, while aproE gene expression markedly increased.However, at the same pecan oil dosages, E2 intervention resulted in a slight decrease in PS-1 gene expression but did not affect.The differences in aproE gene expression among these three pecan oil dosage groups disappeared. Conclusion: Both E2 and pecan oil PS-1 can attenuate PS-1 gene expression and elevate aproE gene expression so as to reduce Aβ level. Their regulatory effects on PS-1 gene might be achieved by different pathways; however, the same pathway seem to be used by them to regulate aproE gene.

Key words：RT-PCR；PS-1；apoE；Aβ ；ovariectomized rats

早老性痴呆(AD)的发生最终都可归结于淀粉样蛋白前体(APP)加工方式改变，从而导致β淀粉样肽(Aβ)产生增加、沉积[1]，对神经细胞产生的毒性作用，这一过程的影响因素包括遗传学改变、细胞老化、炎性反应、中毒反应及内分泌失调等。有多个遗传基因参与这一过程的调节，Maheswaran等[2]的研究发现野生型早老基因-1(PS-1)转基因鼠海马区脑量减少，而PS-1可通过γ分泌酶活性调节Aβ的产生，说明PS-1与AD的关系密切。其他的研究则揭示载脂蛋白E(apoE)可与脂蛋白受体相互作用，具有输送和调节脂类代谢的作用[3]，神经细胞apoE可与Aβ结合，形成apoE-Aβ复合物由中性粒细胞通过LRP介导清除[4]。我国传统医学认为山核桃具有健脑、抗衰老作用，可延缓AD的发生，然而这一作用的基因途径并不清楚。近来的研究也表明，核桃油具有抗氧化[5-6]、降低胆固醇[7]，提高大鼠学习能力[8]的作用，这都为核桃油的抗衰老作用提供了证据。在AD病例中，女性是男性的2倍以上[9]，且在绝经后发病增加[10]，另外的研究也表明雌激素可减少Aβ水平[11-12]。说明AD的发生与雌激素的关系密切，研究发现雌激素不仅可使成年AKR 鼠脑皮质PS-1基因表达与蛋白表达下调[13]，减少Aβ的沉积，还可通过刺激α分泌酶的活性来调节APP代谢，减少Aβ的聚集[11]。山核桃的作用是否通过对PS-1、apoE的调节实现，以及其作用是否会受到体内雌激素水平的调节，目前并没有明确的报道。本研究旨在观察雌激素与野生山核桃油共同作用时对去卵巢大鼠海马PS-1和apoE表达及内Aβ水平的影响，以探讨其抗衰老作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

吉林野生核桃取其仁，烘干粉碎后，用石油醚在55℃水浴索氏提取6h，提取率为64.97%，油色淡黄，有香味；主要含有亚油酸63%、油酸18%、硬脂酸2%、棕榈酸3.9%等脂肪酸及微量的VE。

血清雌二醇(E2)放射免疫分析药盒 北京市福瑞生物工程公司；苯甲酸雌二醇 天津金耀氨基酸有限公司；Aβ放射性免疫试剂盒 天津九鼎医学生物工程有限公司；Trizol RNA分离试剂、逆转录试剂盒 Invitrogen公司。

γ放射免疫计数仪 安徽合肥科大创新有限股份公司；TC-512型PCR仪 英国Techne公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作与分组

去卵巢大鼠模型制作：Wistar成年雌性大鼠64只，10月龄，体质量(230±20)g，购于吉林大学白求恩医学部实验动物中心。大鼠适应性1周后，腹腔注射1g/100mL戊巴比妥钠(30mg/(kg bw·d))麻醉、固定，背部切口去双侧卵巢，分层缝合。去卵巢1周后，阴道涂片，已无性周期变化。

实验分组：模型大鼠随机分成8组(n=8)，对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、E2组、低剂量+E2组、中剂量+E2组、高剂量+E2组，前4组大鼠灌胃给与不同剂量核桃油：100mg/(kg bw·d)(低剂量组)、200mg/(kg bw·d)(中剂量组)、400mg/(kg bw·d)(高剂量组)，对照组灌胃给予生理盐水，持续9周；后4组大鼠除接受与前4组对应的相同处理外，还接受雌激素处理，每只每3d腹腔注射苯甲酸雌二醇10μg；前4组与之对应，腹腔注射等体积生理盐水。

1.2.2 E2与Aβ含量的测定

实验结束时，大鼠摘眼球取血，4℃冰箱静置过夜，低速台式离心机3000r/min离心10min，小心吸取上清，按照试剂盒说明书操作步骤测E2的质量浓度，单位用pg/mL表示。大鼠断头取脑在冰台上迅速剥离出海马组织，分为两份，一份称质量、剪碎，加入10倍体积的冷生理盐水，超声匀浆， 4℃、3500r/min离心10min，取上清，按说明书测Aβ含量，用每mg匀浆蛋白中含pg表示(pg/mg pro)。另一份检测PS-1、aproE表达。

1.2.3 RT-PCR检测PS-1、aproE表达

取海马组织各0.2g (每鼠取0.025g) 置5mL离心管中，加预冷的异硫氰酸胍变性溶液2mL，超声匀浆。匀浆液采用Trizol RNA分离试剂提取RNA。取5μg总RNA，加入1μg的oligo(dT)l2-l8(0.5μg/μL)，按照Super-ScriptⅡ RT逆转录试剂盒产品说明书操作，合成cDNA第1链。PCR引物由primer5.0软件设计， PS-1基因序列中1501～1701，片段长201bp，上游引物：5＇-ctcgccattttcaagaa agc-3＇，下游引物：3＇-gggcttgctctctgtttttg-5＇；apoE基因 856～1064，序列长209bp，上游引物：5＇-ggttcgagccaatagtggaa-3＇，下游引物：3＇-tattaagcaagggccaccag-5＇。各取2μL逆转录产物作为模板。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环后，于72℃延伸7min。并以β-actin为内参照，各取10μL反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果与分析

2.1 血清E2含量测定结果

各组血清E2水平见表1，雌激素处理前后的血清E2水平则差异显著(P＜0.01)，雌激素处理组的E2水平明显高于未处理组。

2.2 海马匀浆液Aβ含量测定结果

海马匀浆液Aβ含量见表2，对照组Aβ含量最高，E2干预后的含量明显下降(P＜0.01)，随着核桃油剂量的增加，海马匀浆液Aβ含量不论是否经过E2处理均为下降趋势，但E2处理后的Aβ含量各组无统计学差异。未经过E2处理的剂量下降更明显，与对照组比较中剂量组P＜0.05、高剂量组P＜0.01，表现为明显的剂量负相关。

2.3 PS-1与apoE的mRNA表达

在实验条件下，PS-1与apoE的mRNA表达水平见图1、3，对电泳图的表达条带进行分析，计算基因与β-actin吸收峰面积的比值，见图2、4。每组2只样本，重复4次。可以看出，未接受雌激素处理的大鼠PS-1的表达最多，apoE的表达最少，随核桃油剂量的增加，PS-1的表达减少，apoE的表达增加，与对照组比较，中、高剂量组差异显著(P＜0.01)；在经过雌激素处理后，较未处理的模型鼠PS-1的表达量虽有所下降，但趋势与未经过雌激素处理组相似；aproE的表达上升，但组间差异减少。

图1 RT-PCR检测不同剂量组PS-1基因表达Fig.1 RT-PCR analysis of PS-1 gene expression in ovariectomized rats treated with pecan oil alone or combined with E2

图2 不同剂量组海马PS-1的表达水平比较(n=4)Fig.2 Effect of pecan oil alone or combined with E2on the relative expression ratio of PS-1 gene

图3 RT-PCR检测不同剂量组aproE基因表达Fig.3 RT-PCR analysis of aproE gene expression in ovariectomized rats treated with pecan oil alone or combined with E2

表1 各组大鼠血清E2水平(n=8)Table 1 Effect of pecan oil alone or combined with E2on E2levels in ovariectomized rats (n=8)

表2 各组大鼠海马匀浆液Aβ含量(n=8)Table 2 Effect of pecan oil alone or combined with E2on Aβ levels in ovariectomized rats

图4 不同剂量组组海马aproE的表达水平比较(n=4)Fig.4 Effect of pecan oil alone or combined with E2on the relative expression ratio of aproE gene

3 讨 论

Aβ与AD发生的关系密切，而 PS-1是γ分泌酶的激动剂，与β-分泌酶协同，剪切APP产生Aβ[14]，aproE则可以结合可溶性APP[15]，发挥清除Aβ的作用。目前大量的研究从Aβ产生与清除的角度来探索AD产生的机制。许多药物都以自己的方式作用于这两个环节，通过对Aβ产生及清除的干预来影响AD的产生和发展。

在本实验中观察到E2可明显的降低海马组织中Aβ的含量，这与以前的研究[4]一致。在低E2水平，核桃油具有明显的降低去卵巢大鼠海马组织中Aβ含量的作用，量效关系明显；而在高E2水平，作用进一步增强，说明E2与山核桃之间有协同作用。这提示核桃油的摄入可以明显降低Aβ水平，起到抗衰老的作用；妇女在更年期后体内雌激素水平明显下降，如果摄入适量的核桃油可降低脑内Aβ含量，具有预防AD的作用。

实验还显示，山核桃油具有减少PS-1表达、增加apoE表达的作用。E2干预使PS-1表达进一步减少，作用相加，可以减少Aβ的生成。apoE的表达在E2干预后增加，而组间差异不明显的结果表明，E2的存在可掩盖山核桃油的作用，而apoE的表达总量不发生改变，二者具有明显的交互作用。可以推测，山核桃油与E2在对PS-1的调节上，具有相对独立性的途径，而对apoE的调节可能通过相同的环节进行调节。

以前的研究[16-17]中发现，E2的降Aβ的作用可以通过增加神经生长因子的表达，激活α分泌酶的活性，使可溶性APP剪切产物增加，以及增加apoE的表达及调节胆碱合成等途径实现。而山核桃油以何种形式进行调节，其机制需进一步研究。总之山核桃油可通过下调PS-1、上调apoE表达来减少Aβ生成与提高Aβ的清除，达到保护神经细胞的作用。特别是对绝经期妇女预防早老痴呆的发生具有积极意义。

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Intervention Effect of Estrogen Combined with Pecan Oil on the Gene Expressions of Alzheimer gene -1 and Apolipoprotein E Gene in Ovariectomized Rat Hippocampus

CHEN Mo-ran1，ZHANG Wei2，SHEN Nan3，ZHAO Xing-yu4,*
(1. Research Division, Jilin Medical College, Jilin 132013, China；2. Department of Biochemistry, Jilin Medical College,Jilin 132013, China；3. Center of Experiment, Jilin Medical College, Jilin 132013, China；4. Department of Psychology,Jilin Medical College, Jilin 132013, China)

TS255.1

A

1002-6630(2010)15-0264-04

2009-12-02

陈默然(1977—)，男，讲师，硕士， 研究方向为生理学。E-mail：jlmmczxy@163.com

*通信作者：赵行宇(1970—)，男，副教授，硕士，研究方向为心理学。E-mail：jlmpcxlx@163.com