双歧杆菌冻干菌粉制备工艺的研究

张 帆，赵 敏，李来酉，鹿晓菲，王 炎，张 锐

(1.东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.河北科技师范学院生命科技学院，河北 秦皇岛 066004；3.哈尔滨工业大学基础与交叉科学研究院，黑龙江 哈尔滨 150001)

双歧杆菌冻干菌粉制备工艺的研究

张 帆1,2，赵 敏1,*，李来酉1，鹿晓菲1，王 炎3，张 锐2

(1.东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.河北科技师范学院生命科技学院，河北 秦皇岛 066004；3.哈尔滨工业大学基础与交叉科学研究院，黑龙江 哈尔滨 150001)

优化双歧杆菌冻干菌粉的制备工艺及检测冻干菌粉在模拟人体胃肠环境中的耐受性和贮存稳定性，采用3种方法制备双歧杆菌冻干菌粉。方法1：双歧杆菌在牛奶还原培养基中的扩大培养液加入甘露醇作为保护剂制备冻干菌粉；方法2：双歧杆菌在PTYG培养基中的扩大培养液经低温离心得到菌泥，向菌泥中加入保护剂甘露醇、增量赋形剂脱脂乳粉制备冻干菌粉；方法3：同方法2得到菌泥，向其中加入保护剂甘露醇、包埋剂明胶及增量赋形剂脱脂乳粉制备冻干菌粉。由方法2得到菌粉活菌数较高，为1.31×1010CFU/g；经模拟胃肠环境处理后，活菌数仍保持在4.19×108CFU/g；对胃酸、胆汁酸具有很高的耐受力。经典加速实验证明由方法2制备的菌粉室温保存1年以上活菌数仍保持在107数量级，具有较好的贮存稳定性。

双歧杆菌；菌泥；冻干保护剂；冻干菌粉；活菌数

Abstract ：This study investigated the preparation of lyophilized powder of Bifidobacterium bifidum and assayed its tolerance to simulated human gastrointestinal environment and stability during storage at 37 ℃. Three methods used to prepare lyophilized powder of Bifidobacterium bifidum were described as follows: Method 1: B. bifidum strain was amplified by culturing in reconstituted milk based medium and mannitol was then added as cryoprotectant to prepare lyophilized powder; Method 2:B. bifidum strain was amplified by culturing in PTYG medium and a bacterial mud was then obtained after hypothermal centrifugation. Finally, mannitol as cryoprotectant was added to the bacterial mud to prepare lyophilized powder; Method 3: A bacterial mud obtained as described in Method 2 was added with mannitol as cryoprotectant, gelatin as embedding medium, skim milk powder as excipient to prepare lyophilized powder. The results indicated that a higher viable count was observed in the lyophilized powder prepared by Method 2, which was up to 1.31 × 1010CFU/g and although exposed to simulated gastrointestinal environment, the lyophilized powder exhibited a viable count of up to 4.19 × 108CFU/g, which suggests that the lyophilized powder has excellent tolerance to gastric acid and bile acid. The classic accelerated experiment proved that the lyophilized power obtained Method 2 had good stability during storage at 37 ℃ and the viable count still kept at a magnitude of 107after storage for up to one year.

Key words：Bifidobacterium bifidum；bacterial mud；cryoprotectant；lyophilized powder；viable count of B. bifidum中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)15-0221-04

双岐杆菌(Bifidobacterium)是人体肠道中最重要的生理性细菌，发挥着生物屏障、营养、免疫、抗肿瘤及改善人体代谢等多种生理作用，被广泛应用于医疗、保健及食品等领域[1]。但双歧杆菌对氧气极为敏感，对低pH值的抵抗力差[2]。液态双歧杆菌制剂的活菌保藏期很短，4℃冷藏也只有5～7d[3-4]。双歧杆菌制品普遍存在着贮存过程中活菌数量衰减快，服用时受胃酸、胆汁酸影响而导致到达肠道活菌数低的问题。目前多采用冷冻干燥、微胶囊及涂膜技术解决双歧杆菌活菌数快速衰减问题[5]。

双歧杆菌冻干菌粉可以抵抗一定的氧分压，保藏期可达1～6个月[6-7]。过去对双歧杆菌冻干菌粉研究，多集中于双歧杆菌培养阶段的研究[8]及菌粉制备方法的开发[9]，而双歧杆菌冻干菌粉贮存特性及其在模拟人体胃肠整体环境中的特性是冻干菌粉在人体胃肠发挥功效的关键，关于双歧杆菌冻干菌粉制备、菌粉特性及其在模拟人体消化环境方面的系统研究并未见报道。

本实验系统研究双歧杆菌的培养、冻干菌粉的制备方法，评价制备的冻干菌粉耐胃酸和耐胆汁酸特性、肠溶性及贮存稳定性，确定制备双歧杆菌冻干菌粉的最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)1.1825(简称双歧杆菌)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，冻干保藏。

PTYG[10]改良培养基：用于双歧杆菌活化及其计数。

人工模拟胃液配制：盐酸16.4mL，胃蛋白酶(3800U/mg)10g，加水摇匀后定容至1000mL，pH1.2。人工模拟肠液配制：磷酸二氢钾6.8g，加水500mL溶解，用4g/L氢氧化钠溶液调pH6.8；另取胰蛋白酶(2500U/mg)10g加水适量使其溶解，将两液混合后，加水定容至1000mL[11]。人工模拟胆汁溶液的配制[12]：7号胆盐(胆盐含量＞65%)溶于水中，质量浓度为10g/L。

1.2 仪器与设备

YQX-1X型厌养培养箱 上海跃进医疗器械厂；LYO-8.7真空冷冻干燥机 上海东富龙科技有限公司；BIOTECH-B-200厌氧发酵罐 保兴生物设备工程有限公司；MLS-3020高压灭菌锅、超低温冰箱 日本Sanyo电器集团；YMQ-MD-4.3灭菌器 哈药股份有限公司宏伟医疗器械厂；DL-CJ-2N高性能无菌实验台 哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 双歧杆菌培养及活菌计数

采用PTYG改良培养基及牛奶还原培养基进行双歧杆菌培养；按东北林业大学微生物及免疫学实验室发明的双歧杆菌双层平板计数法进行计数[13]：待测的双歧杆菌培养液稀释为原菌浓度的10-6～10-7倍，将稀释好的菌液1mL加入到灭菌培养皿中；把加热融化后温度降至40～50℃的PTYG培养基快速倒入培养皿中，用量为10～20mL/平皿，混匀，铺成平板；培养基凝固后，再倒入以隔离氧气为目的保护性覆盖物(溶化后的PTYG固体培养基)，用量为10～20mL/平皿，铺平，静止片刻，待上层培养基凝固，培养24h后开始计数。

1.3.2 双歧杆菌冻干菌粉冻干保护剂的筛选

采用真空冷冻干燥技术制备双歧杆菌冻干菌粉，由于冻干中预冻过程对菌体伤害大，加入保护剂对保证活菌数十分重要。选用甘油、葡萄糖、明胶、甘露醇4种冻干保护剂进行实验研究，其添加质量浓度均为50g/L，研究其保护效果。对照为双歧杆菌培养液不加入保护剂，预冻后直接进行真空冷冻干燥。

由于双歧杆菌活菌冻干前后物理状态不同，所以采用样品冻干后的活菌率来比较冻干过程中保护剂对菌体的保护能力。

1.3.3 双歧杆菌冻干菌粉制备工艺

在预实验基础上，本实验优化获得的3种制备双歧杆菌冻干菌粉工艺，制备双歧杆菌冻干菌粉。参考文献[14]中双歧杆菌生长曲线研究数据，双歧杆菌接种到PTYG改良液体培养基中培养32h进入对数生长期，接种到牛奶还原培养基中培养24h进入对数生长期。

方法1：保藏的双歧杆菌菌种(液体)按照体积比1:10的接种量接种到PTYG改良液体培养基中活化培养，培养基上再加入已灭菌的液体石蜡，用以隔绝氧气，创造厌氧环境，37℃培养32h；取活化后的培养液接种到牛奶还原培养基中扩大培养，接种量为1:10，37℃恒温培养24h；将扩大培养液，加入50g/L甘露醇作为保护剂，－40℃预冻1h，放入真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥[15]20h，得到1号菌粉。

方法2：菌种活化培养同方法1。取活化后的培养液接种到PTYG改良液体培养基中扩大培养，接种量为1:10，37℃恒温培养32h。取扩大培养液加入无菌离心管中，4℃、7000r/min离心10min收集菌体(菌泥)，无菌操作倒出上清液，向离心管中加入保护剂50g/L的甘露醇溶液、增量赋形剂100g/L的脱脂乳粉溶液[16]，混匀，分装，真空冷冻干燥(同方法1)，得到2号菌粉。

方法3：菌种活化培养同方法1。取活化后的培养液接种到PTYG改良液体培养基中扩大培养，接种量为1:10，37℃恒温培养32h。取扩大培养液加入无菌离心管中，4℃、7000r/min离心10min收集菌体(菌泥)，无菌操作倒出上清液，向离心管中加入保护剂50g/L的甘露醇溶液、包埋剂50g/L的明胶溶液[17]及增量赋形剂100g/L的脱脂乳粉溶液，混匀，分装，真空冷冻干燥(同方法1)，得到3号菌粉。

1.3.4 冻干菌粉的特性研究

准确称取0.5g冻干菌粉分别溶于50mL人工胃液、50mL人工肠液及20mL人工胆汁溶液中，37℃、175r/min空气摇床中进行研究：1)冻干菌粉溶于人工胃液中混合2h后活菌计数；2)冻干菌粉溶于人工胆汁溶液中30min后进行活菌计数；3)冻干菌粉溶于人工模肠液中45min后进行活菌计数；4)在模拟人体胃肠整体环境中的特性，冻干菌粉分别经人工胃液处理1h、人工胆汁溶液中处理30min、人工肠液中处理45min后，进行活菌计数。

保质期检测：根据经典恒温法的理论依据Arrhenius指数定律，双歧杆菌冻干菌粉在恒温37℃、相对湿度(RH)60%～65%条件下贮藏3个月，测其活菌数，此活菌数相当于室温下贮藏1年以上双歧杆菌衰减后的活菌数[18]。

2 结果与分析

2.1 菌种活化与冻干保护剂的筛选

2.1.1 双歧杆菌活化培养后菌体的形态

培养的双歧杆菌呈杆状，有的有分支呈Y状，为典型的双歧杆菌生长形态。

2.1.2 冻干保护剂的筛选

表1 双歧杆菌冻干菌粉制备的冻干保护剂筛选Table 1 Screening of cryoprotectants for lyophilized powder of Bifidobacterium bifidum

从表1可以看出，4种保护剂在冻干过程中对双歧杆菌都具有保护作用，不加保护剂时，冻干的活菌率只有2.62%。加入保护剂后，活菌率明显提高。甘油和葡萄糖分别为27.86%和35%，明胶和甘露醇分别为64.18%和88.34%，说明甘露醇和明胶比较适合作为双歧杆菌真空冷冻干燥过程中的保护剂。所以后续的研究主要选取甘露醇作为保护剂。

2.2 预冻温度及预冻时间的研究

本实验双歧杆菌菌液应用真空冷冻干燥机进行冻干，基于冻干室容积，冻干装液容器采用无菌青霉素瓶，装液量均为10mL。选取50g/L甘露醇作为保护剂，预冻前冻干装液容器中总活菌数为6.53×1010CFU。分别将双歧杆菌菌液放入－20、－40、－80℃冰箱中进行预冻，时间分别为30、60、90、120min。

表2 预冻温度及预冻时间对活菌数的影响Table 2 Effect of pre-freezing temperature and time on the viable count of Bifidobacterium bifidum CFU

由表2可知，双歧杆菌菌液预冻过程中，在－20℃与－40℃条件下预冻30min活菌数同预冻前相比下降较少，但预冻状态不佳，菌液中心呈黏液状，不利于后续真空冷冻干燥。双歧杆菌菌液在温度为－40℃条件下预冻60min活菌数下降较少，且菌液预冻物理状态良好。双歧杆菌菌液在温度－80℃预冻30min预冻完全，预冻速度快，活菌数下降较多。因此，双歧杆菌真空冷冻干燥过程中，预冻温度选用－40℃，时间为60min。

2.3 双歧杆菌冻干菌粉特性

2.3.1 双歧杆菌培养及制备冻干菌粉

分别对双歧杆菌冻干菌粉制备方法1～3各工艺的各环节进行活菌计数。方法2、方法3双歧杆菌扩大培养液离心收集的菌泥，也进行活菌计数。结果见表3。

表3 菌种活化与培养后活菌数量变化Table 3 Change in viable count of Bifidobacterium bifidum after strain activation and culture

从表3可以看出，双歧杆菌保藏菌种活化后活菌数有很大提高。方法2、方法3制备冻干菌粉过程均采用低温离心，得到的菌泥活菌数高达1010CFU/g。其中制得的2号菌粉活菌数也达到了1010CFU/g。

2.3.2 冻干菌粉在模拟人体胃肠整体环境中的性质比较

双歧杆菌冻干菌粉要在人体肠道中发挥重要益生作用，故检测了3种方法制备的冻干菌粉在模拟人体胃肠整体环境中的变化。根据1.3.4节的方法，分别对3种冻干菌粉耐胃酸、耐胆汁酸及肠溶性进行研究，并对3种菌粉经历模拟人体胃肠整体环境后到达肠道的活菌数进行检测，同时通过经典加速实验检测3种菌粉保存室温贮存1年活菌数的变化，结果见表4。

表4 3种工艺制备的菌粉的特性Table 4 Characteristics of lyophilized powder of Bifidobacterium bifidum prepared by three technological methods

从表4可以看出，1号菌粉抵抗胆汁酸的能力较强；2号菌粉抵抗胃酸的能力较强，肠溶效果较好；3号菌粉肠溶效果较差，可能是加入明胶后导致肠溶能力不佳。经过模拟人体胃肠整体环境后，活菌数最高的为2号菌粉，仍达到4.19×108CFU/g。

1、2号菌粉单独经肠液处理45min后，其活菌数有较大幅度提高。可能是肠液中含有促进双歧杆菌生长的物质或pH值适合双歧杆菌生长，双歧杆菌通过繁殖增加了数量；3号菌粉明胶使菌体间黏连，导致计数偏低，肠液促进双歧杆菌增殖现象不明显。由此可解释冻干菌粉经模拟人体胃肠整体环境后的活菌数，低于单独人工肠液处理却高于单独人工胃液、人工胆汁溶液处理后的活菌数这一现象。

恒温37℃、RH 60%～65%条件下贮存3个月，测定3种菌粉的活菌数，都达到106CFU/g，这相当于室温条件下储存一年后的活菌数。

3 讨 论

3.1 双歧杆菌扩大培养阶段活菌数达到了7.38×109CFU/mL，比文献[8]报道108CFU/mL高1个数量级。为获得高密度双歧杆菌菌悬液，采用离心扩大培养液的方法得到双歧杆菌活菌数为2.76×1010CFU/g菌泥，比文献[8]报道采用菌液超滤浓缩获得相同数量级高密度菌悬液的方法更加简便易行。

3.2 采用甘露醇作为真空冷冻干燥保护剂，菌粉存活率可达88.34%，相比于姚卫蓉等[19]采用喷雾干燥的方法制备菌粉，菌体存活率为2.3%，袁亚宏等[20]采用真空冷冻干燥方法，菌粉存活率为70%，活菌率相对较高，稳定性较好。

3.3 本研究中由方法2所制备的2号冻干菌粉活菌数达到1.31×1010CFU/g，依据此工艺制备的双歧杆菌冻干菌粉同相关文献[21]其他方法相比较，活菌数相对较高。在胃肠环境中活菌数稳定，经过模拟人体胃肠环境后，活菌数仍可达到4.19×108CFU/g；经典加速实验证明2号菌粉室温保存1年以上活菌数仍保持在107数量级，比文献[17]报道的6.5×105CFU/g要高得多。制备的2号菌粉活菌数高，稳定性较好，确定为3种方法中制备双歧杆菌冻干菌粉的最佳工艺。

[1] 丁可, 余倩. 双歧杆菌检测方法进展研究[J]. 现代预防医学, 2004,31(5): 723-727.

[2] 曹永梅, 许时婴, 张灏. 肠溶性双歧杆菌微胶囊的制备[J]. 食品与发酵工业, 1999(2): 71-74.

[3] 马钢, 刘英华, 姜莹, 等. 双歧杆菌酸奶的研制[J]. 食品与发酵工业,1992(1): 13-17.

[4] COLLINS E B. Bifidobacteria in dairy products[J]. Cultured Dairy Products Journal, 1993, 28(4): 1620-1627.

[5] PICOT A, LACROIX C. Effects of micronization on viability and thermotolerance of probiotic freeze-dried cultures[J]. International Dairy Journal, 2003, 13(6): 455-462.

[6] 钱旭初, 陈彬华, 陈忆恩, 等. 两歧双歧杆菌菌株制剂的研究: Ⅱ, 两歧双歧杆菌及其嗜酸乳杆菌、粪链球菌干燥菌粉胶囊的制备[J]. 微生物学通报, 1990, 17(3): 179-182.

[7] 魏华, 付金衡, 李贤明. 双歧杆菌豆奶粉的研制[J]. 中国乳品工业,1998, 26(1): 10-13.

[8] 李妍, 赵文静, 高鹏飞, 等. 益生菌Lactobacillus casei Zhang增殖培养基的优化[J]. 微生物学通报, 2009, 36(2): 181-186.

[9] 邵伟, 乐超银, 熊译, 等. 双歧杆菌冻干粉制备工艺研究[J]. 现代食品科技, 2008, 21(4): 54-56.

[10] 杜连祥, 赵征. 乳酸菌及其发酵制品生产技术[M]. 天津: 科学技术出版社, 1999.

[11] 蒋爱民, 阳晖, 曹稳, 等. 肠溶性嗜酸乳杆菌微胶囊工艺研究[J]. 中国食品学报, 2006, 6(1): 253-257.

[12] LIAN W C, HSIAO H C, CHOU C C. Viability of microencapsulated bifidobacteria in simulated gastric juice and bile solution[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 86(3): 293-301.

[13] 赵敏. 双歧杆菌等严格厌氧菌的双层平板计数法: 中国, 1940085A[P]. 2007-04-04.

[14] 李德斌. 双歧杆菌微胶囊技术的研究[D]. 哈尔滨: 东北林业大学,2004.

[15] CARVALHO A S, SILVA J, HO P, et al. Survival of freeze-dried Lactobacillus plantarum and Lactobacillus rhamnosus during storage in the presence of protectants[J]. Biotechnology Letter, 2002, 24(19): 1587-1591.

[16] 黄丽金, 陆兆新, 袁勇军. 酸奶菌种冷冻干燥保护剂的筛选研究[J].食品科学, 2005, 26(12): 103-106.

[17] 杨基础, 刘佳. 双歧杆菌固定化的研究[J]. 微生物学通报, 1996, 23(1): 35-36.

[18] 许燕滨, 谢光炎, 杨汝德, 等. 双歧杆菌微胶囊热稳定性研究[J]. 广东工业大学学报, 2001, 18(4): 86-88.

[19] 姚卫蓉, 钱科, 姚惠源, 等. 双歧杆菌活菌粉的制备[J]. 无锡轻工大学学报, 2002, 21(6): 569-573.

[20] 袁亚宏, 岳田利, 高振鹏, 等. 冻干嗜酸乳杆菌菌粉制备及特性研究[J]. 西北农林科技大学学报, 2003, 31(6): 139-142.

[21] 谭海运. 高活性双歧杆菌菌粉的研制[J]. 西藏农业科技, 2005, 27(3):32-37.

Preparation of Lyophilized Bifidobacterium bifidum Powder

ZHANG Fan1,2，ZHAO Min1,*，LI Lai-you1，LU Xiao-fei1，WANG Yan3，ZHANG Rui2
(1. College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2. Life Science and Technology Institute, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, China；3. Academy of Fundamental and Interdisciplinary Sciences, Harbin Institute of Technology, Harbin 150001, China)

2009-12-17

哈尔滨市科技攻关项目(0114211066)；大庆市科技局产业化项目(SCYH2006-007)

张帆(1983—)，女，助教，硕士研究生，研究方向为微生物制药。E-mail：hljszf@163.com

*通信作者：赵敏(1964—)，男，教授，博士，研究方向为生物制药。E-mail：82191513@163.com