外源酶缩短羊肉发酵香肠成熟期的效果研究

杨 华，张 琳，马俪珍，朱迎春

(1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2.天津农学院食品科学系，天津 300384)

外源酶缩短羊肉发酵香肠成熟期的效果研究

杨 华1，张 琳1，马俪珍2,*，朱迎春1

(1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；2.天津农学院食品科学系，天津 300384)

对脂酶、酸性蛋白酶和风味蛋白酶缩短羊肉发酵香肠成熟期的效果进行研究。通过三因子二次通用旋转设计，确定3种酶的最优组合，并测定添加外源酶后发酵羊肉香肠成熟过程中理化指标和感官指标的变化情况。结果表明：3种酶的最优添加质量分数为脂酶0.0022%、酸性蛋白酶0.0011%和风味蛋白酶0.0027%；加酶组成熟到第14天时游离脂肪酸(FFA)的含量、非蛋白氮(NPN)的含量分别达到1.437%、0.647%，与对照组第35天的FFA含量1.382%、NPN含量0.634%无显著差异(P＞0.05)；而在整个发酵成熟过程中，加酶组和对照组的挥发性盐基氮(TVB-N)值和硫代巴比妥酸(TBA)值没有显著差异(P＞0.05)；加酶组成熟第21天时已与对照组成熟第35天的感官质量相似。说明外源酶的添加可以使羊肉发酵香肠的成熟期缩短40%。

外源酶；羊肉发酵香肠；非蛋白氮；游离脂肪酸

Abstract ：The effects of lipase, acidic protease and flavor protease on shortening ripening period of fermented mutton sausage were investigated. The optimal combination of enzymes was determined by using three-factor quadratic rotational composite design. Physicochemical index and sensory index of fermented mutton sausage with added exogenous enzymes were measured.The optimal amounts of three enzymes were found to be: 0.0022% lipase, 0.0011% acidic protease and 0.0027% flavor protease. On the 14thday of ripening, the contents of free fatty acids and non-protein nitrogen in the protease-treated group was 1.437% and 0.647%, respectively, which had no significant difference with those of the control group on the 35thday (P＞0.05). Throughout the whole ripening period, TVB-N and thiobarbituric acid (TBA) exhibited no significant difference between the protease-treated group and the control group (P＞0.05). In addition, similar sensory quality was observed in the proteasetreated group on the 21stday and the control group on the 35thday. Therefore, addition of exogenous enzymes can reduce the required ripening period of fermented mutton sausage by 40%.

Key words：exogenous enzyme；fermented mutton sausage；non-protein nitrogen (NPN)；free fatty acid (FFA)

发酵香肠是一种传统的具有良好耐贮性、风味独特、营养丰富的高档发酵肉制品，但其发酵期较长，生产成本高，因而制约了其在我国的工业化生产。近年来，国内外研究人员致力于研究酶制剂的发酵作用和成熟作用，试图用酶取代发酵剂加入发酵香肠中以达到微生物作用的效果[1]。Ansorena等[2]在发酵香肠中加入微生物来源的蛋白酶时发现非蛋白氮组分明显增加，产品风味增加，而感官性质上无明显差别。Diaz等[3-4]研究添加几种蛋白酶对蛋白质降解的影响，发现加酶组发生了较强的蛋白质降解，木瓜蛋白酶的添加使肌原纤维降解明显，降解过程中出现新的肽组分；Naes等[5]添加细菌蛋白酶提取物使萨拉米香肠的成熟时间缩短了50%；Zapelena等[6]在发酵香肠中添加芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)来源的中性蛋白酶(neutrase)，促进了干发酵香肠的蛋白水解，从而提高了感官特性且不会造成产品软化。Zalacain等[7]分别用胰脂酶、柱状假丝酵母脂酶和Rhizomucor miehei脂酶生产干发酵香肠时发现，游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)中饱和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)比例较高，多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)比例较低，单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)没有显著差异。沈清武等[8]研究了微生物酶与肉组织酶对干发酵香肠中FFA的影响，发现微生物对脂肪的水解主要发生在发酵香肠成熟干燥的后期，而在灌肠后的1周内，脂肪的水解主要是组织酶引起的，微生物对脂肪的水解能力与肉和脂肪组织酶相比要小得多。吕兵等[9]研究了乳酸菌发酵香肠中风味物质的变化，发现发酵香肠中的主要风味物质乳酸、游离氨基酸和游离脂肪酸含量在发酵过程中都有明显增加。尽管外源酶在发酵香肠中的应用有所报道，但同时添加酸性蛋白酶、脂酶及风味蛋白酶来缩短羊肉发酵香肠成熟期的研究鲜有报道。本实验主要采用添加外源酶的方法，对酸性蛋白酶、脂酶及风味蛋白酶加速羊肉发酵香肠成熟进行研究，结果将对实际生产具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊肉、猪背膘 北京某超市；泡菜汁 实验室自制；羊肠衣 石家庄华茂肠衣有限公司；低聚糖、食盐、味精、蔗糖、葡萄糖、白酒、葡萄糖酸-δ-内酯、香辛料等添加剂及辅料均为市售优质品。

风味蛋白酶(酶活力20000U/g)、酸性蛋白酶(酶活力50000U/g) 天津诺奥科技发展有限公司；脂酶(酶活力10000U/g) 深圳绿微康生物工程有限公司；三氯乙酸、浓硫酸、氧化镁、硼酸、三氯甲烷、硫代硫酸钠、硫代巴比妥酸(TBA)、冰醋酸等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HPP-9272电热恒温培养箱 北京东联哈尔仪器制造有限公司；LRHS-150恒温恒湿培养箱、SHZ-B水浴恒温振荡器 上海跃进医疗器械厂；R201D-11旋转蒸发器郑州长城科工贸有限公司；WFJ 2100型可见分光光度计上海尤尼柯仪器有限公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵香肠的生产工艺

1.3.1.1 泡菜汁的制备

原料选择甘蓝和萝卜，用质量浓度为6～8g/100mL的食盐水腌制，并加入少量白酒、辣椒、花椒、姜、蒜等。夏秋季节，泡菜汁中乳酸菌在第5天可达到107CFU/mL；冬春季节在第8天可达到107CFU/mL。之后，分别以少量新鲜的菜和食盐水更替发酵的菜和汁，乳酸菌数稍有下降，但在1～2d后仍能保持在107CFU/mL水平。

1.3.1.2 发酵香肠的生产工艺流程[10]

操作要点：选用羊后腿瘦肉，去除筋、腱、淋巴作为原料肉；接种即将乳酸菌数达到107CFU/mL时的泡菜汁和酶制剂同时加入到肉馅中，泡菜汁接种量为质量分数8%，酶制剂添加量按照试验设计进行；灌好的香肠放入恒温恒湿培养箱发酵48h，发酵温度为33℃、相对湿度(RH)为86%；50℃烘烤6h终止发酵；成熟过程的控制条件为：25℃、RH 85%、时间36～48h；16℃、RH 77%、时间48～72h；10℃、RH 75%、时间25～40d，待成品。

1.3.2 复合酶制剂最佳参数的确定[11]

以脂酶、酸性蛋白酶和风味蛋白酶为主要影响因素，在单因素试验的基础上采用三因子二次通用旋转组合设计制得复合酶制剂。因素水平编码见表1。本试验将反映发酵香肠成熟状况的两个指标作为Y值，分别为发酵15d时香肠的非蛋白氮含量和发酵15d时香肠的游离脂肪酸含量。

表1 三因子二次通用旋转组合设计因素水平表Table 1 Factors and levels in the three-factor quadratic rotational composite design

1.3.3 指标测定方法

1.3.3.1 非蛋白氮(nonprotein nitrogen，NPN)的测定

参照Careri等[12]方法，取5g绞碎样品加入95mL蒸馏水后匀浆，在2000×g、4℃离心10min后过滤，得到滤液。取滤液25mL，加入25mL、20g/100mL的三氯乙酸，室温下静置30min后双层滤纸过滤，得到的滤液即为非蛋白氮提取液，取适量用凯氏定氮法测定其含量。

1.3.3.2 FFA的测定

脂肪的提取方法：准确称取绞碎的发酵香肠样品5g，置于三角瓶中，加入60mL三氯甲烷-甲醇混合液(2:1，V/V)；振荡2h后，过滤；滤液中加入1g/100mL NaCl溶液(滤液与NaCl溶液体积比2:1)，振荡分层；取下层脂肪液，旋转蒸发回收溶剂后得脂肪，然后称其质量。参照GB/T 5530—1998《动植物油脂酸价和酸度测定》测定成熟过程中的FFA含量。

成熟的样品由北京市营养源研究所分析室按照AOAC 996.06(内标法)测定产品中FFA的含量。

1.3.3.3 挥发性盐基氮(TVB-N)的测定

参照GB/T 5009.44—2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》测定。

1.3.3.4 硫代巴比妥酸(TBA)值的测定[13]

准确称取绞碎的发酵香肠样品10g，置于100mL具塞三角瓶中，加50mL、7.5g/100mL的三氯乙酸溶液(含0.1g/100mL EDTA)，振摇30min，双层纸过滤两次；取5mL上述滤液，加入5mL 0.02mol/L的TBA溶液，混匀，加塞，置于沸水浴中保温40min；取出冷却1h，移入离心管，1600r/min离心5min，上清液中加5mL三氯甲烷，摇匀，静置分层后，取上清液分别在532nm和600nm波长处比色，记录吸光度，并计算TBA值。与TBA反应的物质的量是以每千克肉中丙二醛的毫克数来表示。

式中：A532nm和A600nm分别为溶液在波长532nm和600nm处的吸光度；155为摩尔吸光系数；72.6为丙二醛的分子质量。

1.3.3.5 氨基酸成分含量测定

参照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》方法，由北京市营养源研究所分析室测定。

1.3.3.6 感官评定方法

由10人组成感官评分小组，以色泽、质地、风味、切片性、肠体质量作为感官评分的指标，总分100，具体分值见表2。

表2 发酵香肠感官评定表Table 2 Composition of sensory evaluation score of fermented mutton sausage

2 结果与分析

2.1 3种酶制剂复配的优选

2.1.1 以FFA含量为考核指标的统计分析结果

表3 三因子二次通用旋转设计试验的回归和显著性结果Table 3 Regression coefficients of the fitted regression equation and corresponding significance

采用三因子二次通用旋转设计统计软件对实验数据进行处理，结果如表3所示。以FFA含量为因变量，脂酶、酸性蛋白酶和风味蛋白酶为自变量的回归方程：

对此方程进行二次F检验，得出失拟检验F1＝4.9381＜F0.05(1,10)=4.96，差异不显著说明此回归模型所考虑因子足以反映试验中3因子(脂酶添加量、酸性蛋白酶添加量、风味蛋白酶添加量)对FFA含量的影响。拟合检验F2＝8.9925＞F0.01(9,10)=4.94，差异达到极显著水平，说明此回归方程在此试验中有意义。中心标准化了的数据，消除了量纲上的差异，可以直接从回归系数绝对值的大小来分析各因子的改变对发酵香肠FFA含量影响的大小。由表3可知，3个一次项的回归系数绝对值大小依次为X1＞X3＞X2。说明脂酶添加量对FFA的含量影响最大，风味蛋白酶添加量次之，酸性蛋白酶最小。脂酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶各自的添加量分别为0.0022%、0.0011%、0.0027%。

对各偏回归系数进行F检验可知，脂酶对发酵香肠的FFA含量有显著影响，脂酶添加量和酸性蛋白酶添加量之间存在显著交互作用，其他因素间交互作用极小，可以忽略。

2.1.2 以非蛋白氮含量为考核指标的统计分析结果

利用上述同样方法对非蛋白氮(NPN)进行统计分析，可以得到3因子的极值点编码值为：X1＝0.3161、X2＝0.5947、X3＝0.9683。将编码值换算成实际值，可以得到3因子的最佳水平为：x1=0.0018%、x2＝0.0014%、x3＝0.0039%。

2.1.3 优选实验

三因子二次通用旋转设计中，对FFA和NPN两个Y值进行分析，得出两组最优组合，依次为实验组T1(脂酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶的添加量分别为0.0022%、0.011%和0.0027%)和实验组T2(脂酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶的添加量分别为0.0018%、0.0014%和0.0039%)，二者有所差别，还需作进一步的优选实验。以这两组分别为实验组实验组T1、实验组T2，不加酶作为对照组(CK)，对其进行感官分析，结果见表4。

表4 复合酶发酵制得的羊肉香肠的感官评定结果Table 4 Sensory scores of fermented mutton sausage treated with compound enzymes with optimum composition for achieving maximum content of free fatty acids or maximum content of non-protein nitrogen

实验组T1的香肠肠体饱满有弹性，肠衣干燥完整且紧贴肉馅，切面整齐无软化现象，肠馅颜色鲜艳呈玫瑰红色，有光泽，滋味咸淡适中，无膻味，有发酵香肠的酸香味；实验组T2的风味、切片性和肠体质量与实验组T1无显著差异，但是色泽和质地不及实验组T1。由感官评定结果可知，实验组T1明显好于对照组和实验组T2，因此应选实验组T1，即由分析FFA指标所得的结果为最佳组合。即脂酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶各自的添加量分别为0.0022%、0.0011%、0.0027%。

2.2 优选的复合酶在发酵羊肉香肠中的应用效果

以不加酶组作为对CK组，加酶组(2.1.3节中得出的最优复合酶组合)为实验组即实验组T1，研究它们在发酵成熟过程中的理化指标和感官指标变化情况，以进一步确定添加复合酶后对加快发酵香肠成熟的效果。

2.2.1 FFA、TBA值的变化

图1 成熟过程中FFA的变化情况Fig.1 Change of FFA during ripening

由图1可知，在新鲜肉馅中FFA的含量非常低，总含量约0.54%。随着发酵香肠的发酵成熟，发酵香肠中FFA含量不断增加，整个成熟过程中都呈现上升趋势，到成熟结束，CK组的FFA含量增加了2.5倍，实验组增加了3.5倍。CK组和实验组都在前7d内FFA含量增加的速率较快，到成熟后期上升的趋势明显减慢，这是因为酶活力逐渐下降的同时，一部分FFA发生了氧化。实验组发酵成熟到第14天时即达到1.437%，与CK组第35天的1.382%无显著差异(P＞0.05)。说明添加复合酶的实验组成熟第14天就已经达到不加酶的对照组成熟第35天的脂肪水解度。

图2 成熟过程中TBA值的变化情况Fig.2 Change of TBA value during ripening

由图2可知，CK组和实验组在前14d一直呈现上升趋势，在第14天到第21天期间有所下降，这可能是因为丙二醛与氨基酸等物质发生反应，致使其含量下降。到成熟终点35d时，CK组的TBA值为4.82mg/100g，T组的TBA值为5.07mg/100g，二者无显著差异(P＞0.05)，并且没有超过正常油脂TBA值的上限6.64mg/100g。这可能是由于脂酶虽然加速了脂肪的水解，产生了较多的FFA，但是此种脂酶更有利于SFA的释放，与SFA相比不饱和脂肪酸更易氧化。很多研究都证实加发酵剂和脂酶的香肠，虽然在成熟过程中会引起FFA的增加，但通常不会明显加速脂肪酸败[7,14]。

2.2.2 NPN、TVB-N的变化

图3 成熟过程中NPN的变化情况Fig.3 Change of NPN during ripening

从图3可知，随着成熟时间的延长，CK组和实验组的NPN含量均逐渐增加，在前21d内NPN含量增加的幅度较大，之后由于降解产生的一部分短肽和游离氨基酸参与挥发性物质的形成，NPN的增加速率逐渐变缓。实验组发酵成熟到第14天时NPN含量即达到0.647%，与CK组成熟到第35天的0.634%无显著差异(P ＞0.05)。

从图4可知，在整个发酵过程中CK组和实验组的TVB-N值都是持续上升的。在发酵前期TVB-N值上升的速率较小，这是因为此时乳酸菌的生长比较旺盛，抑制了腐败菌的生长。到了第21天以后，乳酸菌生长减弱，TVB-N值开始大幅上升。到成熟终点TVB-N值分别达到了18.63mg/100g和19.66mg/100g，没有超出国标规定的上限20mg/100g。在整个发酵成熟过程中，CK组和实验组的TVB-N值没有显著差异(P＞0.05)。

图4 成熟过程中TVB-N值的变化情况Fig.4 Change of TVB-N value during ripening

2.2.3 氨基酸含量的分析

表5 成熟35d后发酵香肠中氨基酸的含量Table 5 Amino acid composition of fermented mutton sausage with and without added compound enzymes on the 35thdays of ripening g/100g

从表5可以看出，发酵香肠成熟第35天时，含量较高的游离氨基酸主要有天门冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、亮氨酸和赖氨酸等。实验组的大部分氨基酸含量比CK组要小，这是由于发酵香肠中蛋白质在复合酶的作用下，在成熟前期快速降解生成大量游离氨基酸，游离氨基酸进一步通过Strecker降解和美拉德反应产生风味化合物，这就使得实验组的游离氨基酸含量下降的较快，最终发酵35d后实验组发酵香肠中的游离氨基酸总和较CK组要少。

2.2.4 感官评定

将CK组第35天的样品和实验组第14、21天和35天的样品分别进行感官评定，结果见表6。

表6 发酵香肠成熟第14、21、35天的感官评定Table 6 Sensory scores of fermented mutton sausage with added compound enzymes on the 14th, 21stand 35thday of ripening

由表6可知，实验组成熟第14天时风味与CK组存在显著差异(P＜0.05)，导致其总分较低，实验组成熟第21天时已与CK组无显著差异(P＞0.05)，最后的综合评分也相差无几。说明实验组成熟第21天时已与CK组成熟第35天的感官质量相似。实验组成熟第35天时，风味比CK组要浓郁，且质地较紧实致密。最后的综合评分也明显优于CK组。

3 讨 论

3.1 添加外源酶加速发酵香肠成熟期的探讨

研究人员对干发酵香肠成熟过程中的脂肪和蛋白质变化及其与芳香成分的关系进行了研究后发现，添加脂酶和蛋白酶会促进FFA和游离氨基酸的释放，较快地提供可转变成芳香化合物的底物，从而缩短产品的成熟时间。Zalacain等[15]研究了在口利左香肠中添加从假丝酵母中提取的脂肪酶，发现FFA明显增加，并且没有不良风味出现，另外还选用两种商业生产的从根霉中提取的酶，发现其可以提高产品的感官质量，缩短成熟时间。Naes等[5]研究了乳酸菌NCDO151蛋白酶的作用，发现其在香肠成熟过程中对丝氨酸的作用位点。本实验结果表明：与对照组相比，实验组的蛋白质降解加强以及谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸的量增多；感官分析表明，添加蛋白酶的香肠在第14天时风味、酸度、硬度等方面达到了成熟要求；添加蛋白酶可以使成熟时间缩短30%～50%。本实验将脂酶、酸性蛋白酶和风味蛋白酶复配使用，确实可以加速发酵羊肉香肠的成熟，从NPN和FFA的变化情况可以得出添加复合酶可使香肠的成熟期缩短21d(由35d缩短至14d)以上，但是考虑到这些风味化合物的底物要进一步转化为风味物质还需一定的时间，即虽然第14天时实验组的NPN和FFA与对照组相比已无显著差异，但是其风味并未达到发酵香肠的要求，所以将成熟期缩短40%(成熟期21d)是现实可行的，与Naes等[5]的研究结果相一致。

3.2 添加外源酶对蛋白质降解的影响

Naes等[16]从乳酸菌NCDO151中提取出蛋白酶，对其加速干发酵香肠成熟作了初步研究。研究者发现，蛋白酶的添加使pH值迅速下降，可溶性蛋白质快速降解，其蛋白质存在形式在2～3d左右即与对照组发酵42d的相似。由此得出结论，这种蛋白酶可以用于加速发酵香肠成熟。Diaz等[3]研究了在西班牙干发酵香肠中添加从链霉菌中提取的链霉蛋白酶，从曲霉中提取的天门冬氨酸蛋白酶和木瓜蛋白酶。通过电泳发现，实验组的大分子量的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的蛋白水解作用更加强烈，尤其是添加天门冬氨酸蛋白酶的一组更为明显。本实验添加复合酶组发酵成熟到第14天时NPN含量与对照组成熟到第35天无显著差异，说明复合酶也可有效的促进蛋白质的降解。

3.3 添加外源酶对脂肪降解的影响

脂肪降解产生的FFA是干发酵香肠中的风味物质或风味物质的重要前体物质，发酵香肠在成熟过程中一定程度脂肪的水解和一定量FFA的释放对发酵香肠独特良好风味的形成具有非常重要的作用。Fernandez等[17]在干发酵香肠中添加了胰脂肪酶，结果发现，加入脂肪酶的干香肠在成熟过程中的脂肪提前水解了，而且生成更多的FFA、甘油二酯及单酯，从而直接影响干香肠在成熟过程中风味物质的形成。Zalacain等[18]研究了微生物来源的脂肪酶(分别来源于酵母和霉菌)在干发酵香肠成熟过程中的作用。研究发现，用来源于圆柱假丝酵母(Candida cylindracea)的脂肪酶代替微生物发酵剂进行干香肠的生产，在成熟过程中脂肪水解的活性明显提高，但对产品的风味特性影响不大。研究还发现，加酶组FFA中SFA比例较高，PUFA比例较低，而MUFA没有显著差别。此结果被解释为以上脂酶可能更有利于SFA的释放。本实验试图通过加入外源脂酶促进发酵香肠中脂肪的降解，从而加速发酵香肠的成熟，并促进风味物质的形成。研究表明，添加复合酶后TBA值并没有因为FFA含量的增加而上升，可以解释为所加的外源脂酶更有利于SFA的释放，与SFA相比PUFA更易氧化。Zalacain等[19]也得出了同样的结论，用柱状假丝酵母脂酶制造发酵香肠时成熟过程中脂肪酸的氧化作用，发现加脂酶组与加发酵剂组脂肪的过氧化物值和TBA值无显著差异。

4 结 论

4.1 通过试验优选出复合酶的最佳添加量为：脂酶0.0022%、酸性蛋白酶0.0011%、风味蛋白酶0.0027%。

4.2 添加复合蛋白酶样品中的TVB-N、TBA与对照相比，差异不显著(P＞0.05)，但是FFA含量和NPN含量与对照组存在显著差异(P＜0.05)。分析FFA含量和NPN含量，可知加酶组成熟第14天即与对照组成熟第35天相似，但是通过感官评定可知加酶组第14天时并未达到发酵香肠成熟时的感官质量要求，加酶组成熟到第21天时感官评定与对照组无显著差异(P＞0.05)。考虑到这些风味化合物的底物要进一步转化为风味化合物需一定的时间，故最终确定添加复合酶后发酵香肠的成熟期为21d，成熟期缩短40%。

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Effect of Exogenous Enzymes on Shortening Ripening Period of Fermented Mutton Sausage

YANG Hua1，ZHANG Lin1，MA Li-zhen2,*，ZHU Ying-chun1
(1. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China；2. Department of Food Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China)

A

1002-6630(2010)15-0081-06

2009-10-21

山西农业大学创新基金项目(2005005)

杨华(1979—)，女，讲师，硕士，主要从事肉品科学与技术研究。E-mail：sxndyh111@163.com

*通信作者：马俪珍(1963—)，女，教授，博士，主要从事肉品科学与技术研究。E-mail：malizhen-6329@163.com