双液相法提取高粱蜡条件优化及其性质研究＊

刘明,谭斌,谭洪卓,田晓红,沈群

1(国家粮食局科学研究院,北京,100037) 2(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083)

双液相法提取高粱蜡条件优化及其性质研究＊

刘明1,谭斌1,谭洪卓1,田晓红1,沈群2

1(国家粮食局科学研究院,北京,100037) 2(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083)

以蜡提取率为指标,采用乙醇-水-正己烷双液相溶剂法回流提取高粱蜡,应用三因素二次回归通用旋转组合设计,对影响蜡提取的主要因素进行优化。高粱蜡的最佳提取条件为烷料比(mL∶g)7.21∶1,醇料比(mL∶g)9.92∶1,提取时间80 min,在此条件下高粱蜡提取率的理论值可达0.3018%。在优化条件下进行验证试验提取率为0.2975%。提取的高粱蜡的基本理化性质为:色度(L＊a＊b＊)分别为45.01±0.05、9.60±0.12和14.80±2.26,酸值10.98±0.29,碘值18.94±0.29,皂化值77.53±0.47。高粱蜡熔点为66.5-77.6℃,与巴西棕榈蜡接近,高于米糠蜡、蜂蜡和石蜡。高粱蜡中二十八烷醇和三十烷醇含量分别达到21.97%±0.12%和24.73%±0.22%。

高粱蜡,双液相法,响应面分析,二十八烷醇,三十烷醇

高粱[Sorghum bicolor(L.)Moench]是世界上第五大重要的粮食作物,具有高产、抗旱、抗盐碱、抗涝、耐贫瘠等特点,是一种生态环境友好型的粮能兼用作物。目前,世界高粱约50%用于饲料,其余用于食品、燃料乙醇等其他用途,在非洲和亚洲部分国家是一种重要的人类口粮,中国的高粱主要用于食用白酒的酿造与饲料[1-3]。近年来,由于具有独特的环境适应性、不含面筋、不易消化、富含多酚类化合物与高级烷醇等植物化学素组分等独特的营养保健特性与加工特性,高粱作为一种健康食物资源的开发日益引起了学界的广泛关注。

高粱蜡是一种主要存在于高粱籽粒外表皮和高粱茎叶表面优良的天然蜡资源,其性质与国际上交易量巨大的巴西棕榈蜡相似。同时,高级烷醇占高粱蜡的19%-46%,游离形式的二十八烷醇与三十烷醇含量最丰富。高级烷醇的降低血液胆固醇的能力可以与Statins(为目前最流行也是最贵且有潜在副作用的药物)比美。目前商业化的烷醇类主要是通过对甘蔗蜡水解与进一步纯化得到的[2-4]。高粱蜡的开发利用具有极大的开发潜力。国外学者对高粱蜡的研究比较早,采用正己烷、苯、石油醚、三氧甲烷、丙酮、乙醇等有机溶剂提取高粱蜡[4-8],在国内对高粱蜡的提取及其性质研究则刚刚起步。本研究拟采用双液相溶剂法提取高粱蜡,优化高粱蜡提取溶剂和提取条件,并对高粱蜡的基本理化性质和高级烷醇含量进行了分析研究,以期促进我国高粱及高粱蜡资源的深度开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高粱籽粒,阜杂1号,采自辽宁朝阳。收集整个高粱穗,并用封口袋包装,防止谷粒表皮破损,收集后脱壳4℃保存。正己烷、乙醇、丙酮、三氯甲烷、石油醚、苯、甲醇、异丙醇、乙酸乙酯,乙醇等有机溶剂为分析纯;米糠蜡、巴西棕榈蜡、小烛树蜡、蜂蜡、石蜡等均为市售。

1.2 仪器与设备

SXT-02索氏提取器(上海洪记),布式漏斗,BCD-187A IC冰箱(合肥美菱),6NS-20-4K W碾米脱皮机(山东激流),TDL-5A台式离心机(上海安亭),DGG-9140BD鼓风干燥箱(上海森信),DSC 200F3差示扫描量热仪(德国耐驰),CR400型色差计(日本美能达),万能粉碎机(天津泰斯特),电子天平(梅特勒-托利多),6890N气相色谱(美国Agilent Technologies),7683B自动进样器(美国Agilent Technologies)。

1.3 试验方法

1.3.1 高粱蜡的制备

高粱籽粒、脱皮高粱和麸皮分别置于装有有机溶剂的索氏提取器中,在溶剂沸点温度附近回流2h,采用5000 r/min离心20 min,上清液在-5℃下冷冻12 h将蜡析出,布氏漏斗真空过滤后干燥即为高粱蜡。

1.3.2 高粱蜡含量测定[9]

在-5℃下冷冻12 h析出溶剂后,用布氏漏斗抽滤,为了防止蜡质残留在漏斗上,冷冻12 h和布氏漏斗真空过滤重复2次。蜡含量按下列公式进行计算:

式中:X:蜡含量,g;m:回流固体质量,g;m1:干燥后质量,g;m0:滤纸原质量,g;c:水分含量,%。

1.3.3 水分含量测定

水分含量按照国标方法测定[10]。

1.3.4 颜色测定

色度采用L＊a＊b＊色空间法,其中L＊为蜡的亮度;a＊和b＊为色度,+a＊为红色方向,-a＊为绿色方向;+b＊为黄色方向,-b＊为蓝色方向,颜色的校准用CR-400的标准白板。

1.3.5 热力学性质

采用差示扫描量热仪(DSC)。称取蜡样品5 mg,压片,以空铝盒作参比。从25℃加热至100℃,扫描速率为5℃/min,记录每份样品的焓和起始温度、峰值温度和终止温度。

1.3.6 酸值、碘值、皂化值

采用蜂蜡国家标准方法测定[11]。

1.3.7 醇相皂化法制备高级烷醇

称取从10 g高粱中提取的高粱蜡,置于250 mL三角瓶中,加入100 mL体积分数95%乙醇,同时加入过量的NaOH,85℃水浴加热搅拌,并置于索式提取器中85℃下回流2 h。降温至50℃后加入100 mL苯,搅拌40 min,再加入100 mL蒸馏水,倒入分液漏斗中50℃保温静置分层液液相分离,取苯萃取物在25℃下冷析结晶,抽滤,洗涤,得长链脂肪醇混合物。

1.3.8 二十八烷醇和三十烷醇的测定

1.3.8.1 气相色谱操作条件

色谱操作条件为:色谱柱,HP-5(30 m×320 μm×0.25μm);柱温,240℃保持1 min,以20℃/min速度升至300℃保持15 min;汽化室温度,320℃;检测器温度:330℃;载气(N2)流速,45.0 mL/min;氢气(H2)流速,40.0 mL/min;助燃气(air)流速,450 mL/min;进样量1μL;分流比,4∶1;恒流。

1.3.8.2 二十八烷醇、三十烷醇标准曲线

准确称取二十八烷醇和三十烷醇标准品各0.0500 g(精确至 0 .0001g)置于25 mL容量瓶中,用环己烷溶解定容作为标准溶液,浓度为2 mg/mL。准确称取三苯基苯0.0600 g(精确至0.0001)置于100 mL容量瓶中,用环己烷溶解定容作为内标溶液,浓度为 0 .6 mg/mL。分别移取 0 .5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL标准溶液,加入0.5 mL内标溶液置于10 mL容量瓶中,配成二十八烷醇和三十烷醇浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL,三苯基苯浓度为0.03 mg/mL的浓度梯度溶液。梯度标准溶液分别进样1μL,进行测定,得到气相色谱图,时间为横坐标,相应值为纵坐标的图谱。以不同梯度标准溶液浓度为横坐标,分别以各梯度溶液二十八烷醇和三十烷醇的出峰面积与内标三苯基苯的出峰面积的比值为纵坐标,作标准曲线。图1,图2分别为高级烷醇混标高级烷醇混标气相色谱图和二十八烷醇和三十烷醇标准曲线。由图1,图2得到回归方程为y1=20.365x+0.025,R2=0.9953;y2=18.994x-0.0005,R2=0.9935。

图1 高级烷醇混标气相色谱图

图2 二十八烷醇和三十烷醇标准曲线

将皂化样品置于100 mL容量瓶中,加入内标物三苯基苯,用环己烷溶解定容,并超声溶解。抽取高粱样品溶液1μL,进样后测定,得到溶液中二十八烷醇和三十烷醇的峰和内标三苯基苯的峰,分别将二十八烷醇和三十烷醇的出峰面积与三苯基苯出峰面积的比值代入回归方程得到样品溶液中二十八烷醇和三十烷醇的含量,从而计算出高粱中二十八烷醇和三十烷醇的含量。

1.3.9 数据处理

不同溶剂提取高粱蜡比较如图3所示。数据采用统计均数(平均数)±标准差来表示,用t检验进行显著性分析。实验数据用SAS8.2统计软件进行方差与回归分析拟合出模型,并采用Mathematica5.2软件作图。

2 结果与讨论

2.1 不同溶剂提取高粱蜡能力比较

不同溶剂提取高粱蜡比较如图3所示。

图3 不同溶剂提取高粱蜡比较

比较高粱全粉、麸皮和去皮高粱中高粱蜡含量,发现在高粱籽粒中,蜡主要存在于高粱的麸皮中。8种有机溶剂提取高粱蜡的能力依次为乙醇>正己烷>甲醇>乙酸乙酯>石油醚>异丙醇>三氯甲烷>苯。为了进一步提高溶剂对高粱蜡的浸出率,采用乙醇和正己烷2种溶剂复配共同作用提取高粱蜡。

2.2 乙醇-水-正己烷双液相法提取高粱蜡

为考察乙醇-水-正己烷双液相法对高粱蜡提取的作用,对乙醇、正己烷及乙醇-水-正己烷体系提取做预试验,结果显示,体积分数100%乙醇的提取率为 0 .0967%±0.0081%,100%正己烷的提取率为0.0787%±0.0006%,乙醇-水-正己烷以体积分数4∶1∶5比例的双液相体系提取率为0.1344%±0.0126%,远远高于单独使用乙醇或正己烷的蜡提取率。

2.3 单因素试验提取

2.3.1 烷料比对高粱全粉蜡提取率的影响

在预试验的基础上,固定单因素试验的基本参数为醇料比(mL∶g)8∶1,乙醇体积分数80%,回流时间60 min,温度78.3℃,研究不同烷料比对高粱蜡提取率的影响,其结果见图4。由图4可以看出,在烷料比2∶1-4∶1,高粱蜡的提取率随正己烷加入量的提高而升高,4∶1以后,随着正己烷加入量的增加高粱蜡的提取率有所下降,在4∶1具有最高点。

2.3.2 醇料比对高粱全粉蜡提取率的影响

固定单因素试验的烷料比为10∶1,乙醇体积分数80%,回流时间60 min,温度78.3℃,研究不同醇料比对高粱蜡提取率的影响,结果见图5。由图5可以看出,乙醇加入量对于高粱蜡的提取率影响较大,在8∶1前,随着乙醇加入量的增加,高粱蜡的提取率有所提高,在8∶1以后提取率则随着乙醇的加入而有所下降。

图4 烷料比对高粱蜡提取率的影响

图5 醇料比对高粱蜡提取率的影响

2.3.3 回流时间对高粱全粉蜡提取率的影响

确定进行单因素试验的基本参数为烷料比为10∶1,醇料比8∶1,乙醇体积分数80%,温度68.7-78.3℃,研究回流时间对高粱蜡提取率的影响,其结果见图6。由图6可以看出,回流时间对于高粱蜡的提取率影响较大,在70 min前,随着回流时间的增加,高粱蜡的提取率有所提高,在70 min以后提取率则随着回流时间的变化不大。

图6 回流时间对高粱蜡提取率的影响

2.3.4 乙醇体积分数对高粱全粉蜡提取率的影响

确定进行单因素试验的基本参数为烷料比为10∶1,醇料比8∶1,回流时间60 min,温度68.7-78.3℃,研究乙醇体积分数对高粱蜡提取率的影响,其结果见图7。由图7可以看出,在乙醇体积分数低于60%时,蜡的提取率随着乙醇体积分数的增加而提高,超过60%后,高粱蜡的提取率有所下降。在乙醇体积分数为60%时获得最大的蜡提取率。

图7 乙醇体积分数对高粱蜡提取率的影响

2.4 二次回归旋转设计

根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理[12],在单因素影响实验基础上,固定乙醇体积分数为60%,选取烷料比、醇料比和提取时间3个因素,进行三因素的响应面分析优化试验。由p=2查表[13]得m0=5,n=13,r=1.414。确定烷料比x1的零水平为x01=4,△1=2;醇料比x2的零水平为x02=8,△2=2;提取时间x3的零水平为x03=70,△3=20。共有24个实验点,其中20个为析因子,4个为零点。零点实验进行3次以估计误差。设计三因素二次回归通用旋转组合试验,蜡提取率见表2。查表得K=0.2,E=-0.1,F=0.14375,G=0.01875,e-1=0.125和mc-1=0.25,实验以随机次序进行,重复3次,获得的蜡提取率的平均值方程、响应面分析图和方差分析表。采用回归方程:,由表3的数据,计算出回归方程中各系数,见表4。

表1 试验方案及结果

表2 回归方程的方差分析结果

表3 回归系数取值

查表得P=3,K=0.16634,-E=0.05679,F=0.06939,G=0.00689,e-1=0.0732,mc-1=0.125。根据表1试验结果进行计算,得到回归模型为。表2是回归方程的方差分析结果,由表2可以看出,FLf=2.49522F(9,14)0.025=3.21,方程回归显著,说明该模型是可靠的。回归系数取值见表3。

回归模型的响应面图见图8、图9和图10。各图分别表示x1、x2和x3中一个变量取零时,其余2个变量对蜡提取率的影响。

图8 烷料比x1与醇料比x2对蜡提取率影响响应面分析图

图9 烷料比x1与提取时间x3对蜡提取率影响响应面分析图

图10 醇料比x2与提取时间x3对蜡提取率影响响应面分析图

2.5 高粱蜡理化性质分析

图11为高粱蜡与几种常见蜡的DSC分析,表5为高粱蜡与几种常见蜡理化性质分析。由图11可以看出,除蜂蜡出现2个峰外,各种蜡的DSC扫描均出现一个宽峰,其中高粱蜡的熔点范围(66.5-77.6℃),与Kummerow[14]的81℃,Bunger[15]的77-82℃,和Freeman[16]78℃相比略低,与巴西棕榈蜡(77.7-81.5℃)和小烛树蜡(83.3-86.7℃)较为接近,但远远高于米糠蜡、蜂蜡和石蜡的熔点。由表4可以看出,与其他蜡相比,高粱蜡样品中颜色较红,原因在于高粱中含有大量的高粱红色素,部分色素在乙醇溶液中和蜡一起被溶剂提取。测定高粱蜡的酸值为10.98±0.29,与Bunger[15]的10.5-16.22相同,碘值为18.94±0.29,皂化值为77.53±0.47,高于Bunger[15]的16-44。3项指标均在蜂蜡标准的合格范围内[11]。由于蜡的酸值、碘值和皂化值随着贮存时间和贮存条件的不同而明显变化,因此无法将高粱蜡的这几项指标与其他蜡作比较。

图11 高粱蜡与几种常见蜡DSC分析

2.6 高粱蜡中高级烷醇含量分析

高级烷醇(policosanol)是十二个碳原子以上蜡状饱和脂肪醇[17],对动植物具有重要的生理活性[18],其中高粱中含量较高的是二十八烷醇和三十烷醇,二十八烷醇和三十烷醇分子式见图12。二十八烷醇具有增进体力、增强耐力、精力[19],提高反应灵敏性和应激能力,提高机体代谢率,改善心肌功能,降低血清胆固醇和甘油三酯含量,降低收缩期血压等功能;三十烷醇对动植物的生长和发育具有特殊的调节和控制作用[20]。

表4 高粱蜡与几种常见蜡理化性质

图12 二十八烷醇和三十烷醇分子式

图13 高粱蜡中高级烷醇含量

高粱蜡是由长链脂肪酸和长链脂肪醇结合成的脂类。由图13可以看出,皂化后样品中含有多种长链的脂肪酸和脂肪醇,其中以二十八烷醇和三十烷醇的量居多,对比标准曲线样品浓度达到(0.06590±0.00036)mg/mL和(0.0742±0.00066)mg/mL。由高粱全粉中高粱蜡含量0.3%,得到高粱蜡中二十八烷醇和三十烷醇含量约为21.97%±0.12%和24.73%±0.22%。与文献报道高粱蜡中高级烷醇含量近似为19%-46%相符[21-23]。

3 讨论

提取出的高粱蜡为暗红色,说明采用三元双液相法提取的高粱蜡中含有部分高粱红色素。而对高粱蜡的性质分析发现高粱蜡具有相对狭小的熔点范围(66.5-77.6℃),高粱蜡中二十八烷醇和三十烷醇含量之和约为46.70%,近似为高粱蜡含量的50%,含量与文献报道的相符,说明提取得到的高粱蜡的纯度较高。因此该方法是一种较好的高粱蜡提取方法,在后续的研究中可对于三元双液相方法提取的高粱蜡作进一步的纯化。

4 结论

(1)高粱籽粒中蜡主要存在于麸皮中。

(2)比较8种溶剂,乙醇和正己烷对高粱全粉中的高粱蜡提取率较高。

(3)乙醇-水-正己烷三元双液相法能有效提高高粱蜡的提取率,应用响应面方法进行高粱蜡乙醇-水-正己烷三元双液相法提取工艺优化,高粱蜡的优化工艺条件为:烷料(mL∶g)比为7.21∶1,醇料比为(mL∶g)9.92∶1,提取时间为80 min,在此条件下提取高粱蜡的理论值可达0.3018%。采用上述最优提取条件进行验证试验,实际提取高粱蜡为0.2975%。

(4)提取高粱蜡的性质如下:色度(L＊a＊b＊)分别为45.01、9.60和14.80,酸值10.98,碘值18.94,皂化值77.53。高粱蜡熔点范围为66.5-77.6℃,与巴西棕榈蜡接近。

(5)高粱蜡中二十八烷醇和三十烷醇含量分别为21.97%和24.73%。

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ABSTRACTSorghum wax was extracted by means of organic dissolvent reflux with two-liquid-phase system.Extraction solvent and technological conditionswere optimized by response surface methodology(RS M).Based on extraction rate,the optimal extraction conditionswere dete rmined as follows:hexane-material ratio 7.21∶1,ethanol-material ratio 9.92∶1 and extraction t ime 80 min.The theoretical value of extraction rate was 0.3018%at the optimum extraction conditions.The actual extraction rate was 0.2975%.The properties of the extracted sorghum wax as follows:Color intensity(L＊a＊b＊)was 45.01±0.05,9.60±0.12 and 14.80±2.26 respectively;Acid number was 10.98±0.29; Iodine value was 18.94±0.29;Saponification value was 77.53±0.47;Melting range was 66.5℃-77.6℃.TheMelting range of sorghum waxwas similar to thatof carnaubawax,and higher than thatof rice branwax,bee swax,paraffin.The contents of octacosanol and triacontanol of saponified in sorghum wax were 0.06590% ±0.00036%and 0.0742%±0.00066%,respectively.

Key wordssorghum wax,two-liquid-phase,response surface methodology,octacosanol,triacontanol

Optim ization of the Extraction of Orghum Wax with Two-liquid-phase System and Properties of the Sorghum Wax

LiuMing1,Tan Bin1,Tan Hongzhuo1,Tian Xiaohong1,Shen Qun2
1(Academy of State Administration of Grain,Beijing 100037,China)
2(College of Food Science and Nutritional Engineering,China AgriculturalUniversity,Beijing 100083,China)

硕士,助理研究员(谭斌副研究员为通讯作者)。

＊科技部“十一五”国家科技支撑计划重点项目课题资助(No.2006BAD02B01)

2009-08-25,改回日期:2010-03-05