白地霉发酵苹果渣的产香特点研究

朱 静，师俊玲，刘拉平

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

白地霉发酵苹果渣的产香特点研究

朱 静，师俊玲*，刘拉平

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

［目的］研究了白地霉TF发酵新鲜苹果渣和干苹果渣的产香特点。［方法］以苹果浓缩汁生产厂的新鲜苹果渣和干燥苹果渣为原料，接种白地霉TF，静置固态培养7d后，用固相微萃取法气相检测发酵体系中的挥发性成分；对照为未接种但经灭菌和相同条件培养后的苹果渣。［结果］共检出化合物86种，鉴定出化合物80种，其中，发酵前后新鲜果渣分别为31种和35种，发酵前后干果渣分别为32种和34种。未发酵苹果渣中的挥发性物质主要是酚、烷类及其它物质和醛、酮、酸类，酯类含量不到总挥发性物质的25%；发酵后苹果渣中挥发性物质中50%以上为酯类物质，醛、酮、酸类相对含量不到15%。发酵后新鲜果渣的主体酯类为2-甲基丁酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、异丁酸甲酯和己酸甲酯，相对含量分别为12.00%、8.50%、6.68%和6.13%；主体醇类为苯乙醇，相对含量为2.28%；发酵后干苹果渣中的主体酯类为4-癸烯酸甲酯、2-甲基丁酸甲酯、3-甲基丁酸甲酯和异丁酸甲酯，相对含量分别为10.40%、9.49%、6.16%和6.09%；主体醇类为苯乙醇，相对含量为4.19%。［结论］白地霉TF发酵能够有效提高苹果渣中呈香性酯类的种类和含量，以及苯乙醇的含量，减少醛、酮、酸、酚、烷类及其它物质的种类和含量，改善苹果渣的风味。

白地霉，苹果渣，香气成分，GC/MS

Abstract：［Objective］The paper aimed at investigating the aroma products by a strain of Geotrichum candidum TF during solid-state fermentation in apple pomace［.Methods］Fresh and dried apple pomace from an apple juice producing industry was used as the materials in the study.The apple pomace were sterilized，inoculated and cultivated with G.candidum TF for 7d.After the cultivation，the volatile substances were analyzed with GC/MS.In the study，the apple pomace undertook same cultivation but not inoculated with G.candidum TF which was used as the contro［l.Results］Eighty six compounds were tested in total and 80 of them were identified，including 31 and 35 compounds in the unfermented fresh and dried apple pomace，respectively，and 32 and 34 compounds in the fermented fresh and dried apple pomace，respectively.Phenol，alkyl-，aldehyde，ketone and other compounds were the principal compounds in the volatile substances in the unfermented apple pomace，while ester took up less than 25%in the total volatile products.For the fermented apple pomace，ester took up more than 50%in the total volatile products，with less than 15%of alkyl-，aldehyde and ketone.In the fermented fresh apple pomace，the principal esters were 2-methyl-butanoic acid-hexyl ester，2-methyl-butanoic acid-methyl ester，propanoic acid-2-methyl-methyl ester and hexanoic acid-methyl ester，with relative content of 12.00%，8.50%，6.68%and 6.13%，respectively，and the principal-ol was phenylethyl alcohol with relative content of 2.28%.In the fermented dry apple pomace，the principal ester was 4-Decenoic acid-methyl ester，2-methyl-butanoic acid-methyl ester，3-methylbutanoic acid-methyl ester and 2-methyl-butanoic acid-methyl ester，with relative content of 10.40%，9.49%，6.16%and 6.09%，respectively，and the principal-ol was phenylethyl alcohol with relative content of 4.19%.［Conclusion］Fermentation with Geotrichum candidum TF could efficiently improve the kinds and contents of ester and content of flavor esters and contents of phenylethyl alcohol，and reduce the kinds and content of alkyl-，aldehyde，ketone，phenol，and other compounds，and thus improved the flavor of apple pomace.

Key words：Geotrichum candidum；apple pomace；aroma components；GC/MS

中国是世界上最大的苹果生产国和苹果浓缩汁出口国，产业规模居世界第一。中国的苹果浓缩汁占有全球市场的50%左右，年产鲜果渣近300万t，干果渣 50～60 万 t［1］，除少量被用于制备果胶［2-5］、生产柠檬酸［6-8］、用作食用菌培养基质［9-10］等加工以外，大部分被用作饲料。苹果渣中富含碳水化合物等有机物质［11-12］，但是氮素含量较低。为了提高苹果渣等废渣饲料的营养价值，人们曾尝试通过微生物发酵的方法提高饲料中的蛋白含量［13-15］，均取得了良好的效果。白地霉是饲料生产中常用的微生物菌种之一，广泛地存在于食品和环境中［16］，对培养基营养要求低、适应性强、生长快、生产方法简单、宜于工业化生产，是一种极具发展潜力的工业微生物［17-18］。白地霉菌种TF是前期研究中分离得到的一株能够产生浓郁果香味的菌种。如果能够将该菌种的发酵与苹果渣的综合利用结合起来，则有望提高果渣饲料的风味和蛋白含量，甚至有可能用于生物发酵法生产香味物质，从而为天然香精的生产提供新途径［19］。而且，与动植物提取法相比，微生物发酵法生产香味物质还具有生产季节灵活、操作简便、周期短等优势，具有广阔的发展前景［20］。目前，白地霉发酵苹果渣的研究主要集中在菌体蛋白的利用［13，21］，结果发现，白地霉发酵苹果渣能够有效提高果渣饮料的营养价值，但从未有人注意过产香的问题。王庆国等人［22］曾对两株产果香白地霉在合成培养基上的产香特性进行了初步分析，但有关白地霉在苹果渣中的产香特性研究还未见报道。为此，本文拟对白地霉菌株TF在新鲜苹果渣和干燥后苹果渣上的产香特性进行研究，以期为提高苹果渣饲料的风味和将其用于生产香气成分提供理论依据，为苹果渣的综合利用提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜苹果渣 当天鲜榨苹果渣，由陕西通达果汁集团股份有限公司礼泉分公司提供，含水量为70%，取回后存放于-18℃冰箱中，临用前取出；干燥苹果渣 取上述苹果渣，在60℃烘干48h，含水量为5.89%，备用；培养基制备 新鲜苹果渣直接称取30g，干燥后苹果渣按照原料∶水=1∶2调和，然后称取30g，上述果渣均装于250mL三角瓶中，振荡均匀后使其铺平，厚度约2cm，然后在121℃下灭菌20min，用于接种；白地霉TF 由西北农林科技大学食品学院食品生物工程实验室分离自苹果园土壤，并由该实验室保藏和提供，使用前，将白地霉TF接入PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基，30℃下静置培养7d，用无菌水冲洗收集白地霉孢子，制备孢子悬浮液，经血球计数板测定其中孢子浓度后，用无菌水调整孢子浓度为2.0×107个/mL，备用。

TRACE DSQ GC-MS联用仪 美国Finnigan公司，配有DB-WAX（3m ×0.25mm ×0.25!m）弹性石英毛细管柱（美国Agilent公司产品）、手动固相微萃取（SPME）进样器和50/30!m DVB/CAR/PDMS萃取头（均为美国 Supelco公司）；ES-315全自动高压灭菌锅 广州东南科仪有限公司；SPX-300B生化培养箱 上海跃进医疗器械厂；AIR TECH超净工作台苏净集团安泰公司；HWS-380智能恒温恒湿箱宁波海曙塞福实验仪器厂；气相色谱/质谱联用仪美国Finnigan公司；CS1013型电热鼓风干燥箱 重庆实验设备厂。

1.2 培养方法

在准备好的苹果渣培养基中，接入白地霉孢子悬浮液1mL，搅拌均匀后，在30℃（该菌的最适生长温度）下静置培养7d。培养的前2d用硅胶塞封口，培养第2d以后用封口膜封口。培养结束后，用GC/MS测定瓶中香气成分的种类及其相对含量。对照为经相同处理但不接菌的培养基。

1.3 挥发性气体成分的分析

将培养好的样品和对照样放入30℃水浴中平衡10min；将老化好的固相微萃取器（在气相色谱仪的进样口250℃老化1h）插在样品瓶上，吸附40min后拔出，插入气相色谱仪进样口，于250℃解析5min，进行检测。检测条件为：程序升温40℃，保持2.5min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min升至240℃，保持5min；进样口250℃；传输线230℃；载气为氦气，流速 1.0mL/min；不分流进样。电离方式 EI，70eV；离子源温度250℃，质量扫描范围35～400amu；发射电流100!A，检测电压1.4kV。

1.4 数据处理方法

利用随机Xcalibur工作站NIST2002标准谱库自动检索各组分质谱数据，参考文献资料［23-24］及标准谱图［25］对机检结果进行核对和确认，按面积归一化法计算各组分的含量。

2 结果与分析

实验共检出化合物86种，根据NIST2002标准谱库和参考文献定性出的化合物80种（表1）。定性出的组分分别占发酵前后新鲜苹果渣的94.96%和91.08%，发酵前后干苹果渣的90.15%和91.94%。新鲜果渣和干燥果渣在发酵前后的GC/MS总离子色谱图分别见图1、图3和图2、图4。

图1 未发酵新鲜果渣中挥发性物质的总离子流色谱图

图2 发酵后新鲜果渣中挥发性物质的总离子流色谱图

2.1 香气成分的种类

新鲜果渣在发酵前后的检出物分别为31种和35种，干燥果渣在发酵前后的检出物分别为32种和34种。其中，2-甲基-丁酸丁酯、Glycine，N-［4-［trimethylsilyl）oxy］benzoyl］-，methyl ester、苯乙醇、丙炔酸、十四烷、十六烷是所有样品中的共有物质，丁酸甲酯和己酸己酯是新鲜果渣在发酵前后的共有酯类，但其相对含量在各样品各不相同。除此以外，发酵前后的物质种类各不相同。

表1 白地霉发酵苹果渣所产主要香气成分

续表

检出的挥发性物质主要为酯类、醛、酮、酸类、醇类、酚、烷类及其它物质。总体而言，发酵前果渣中挥发性物质主要是酚烷类，发酵后果渣中挥发性物质主要是酯类；发酵过程增加了果渣中酯类的种类和含量，减少了醛、酮、酸类和酚、烷类等其它物质的种类和含量，发酵后的果渣酯香浓郁。具体分析新鲜果渣和干果渣中各种挥发性物质种类和相对含量的变化可见：a.酯类：发酵前分别为7种，22.85%和7种，16.12%；发酵后分别为20种，52.49%和20种，57.16%；b.醛、酮、酸类：发酵前分别为8种，19.22%和9种，35.66%；发酵后分别只有3种，1.43%和4种，12.47%；c.醇类：发酵前分别为3种，3.20%和3种，3.08%；发酵后分别只有1种，2.28%和1种，4.19%；d.酚、烷类其它物质：发酵前分别为13种，49.69%和 13种，35.29%；发酵后分别为 9种，34.88%和9种，18.12%。

图3 未发酵干果渣中挥发性物质的总离子流色谱图

图4 发酵后干果渣中挥发性物质的总离子流色谱图

2.2 酯类物质

酯类是发酵后果渣中挥发性物质的主要成分。发酵过程中产生的酯类均不同于果渣中原有酯类，未发酵的新鲜果渣和干果渣中的主体酯类分别是2-甲基丁酸丁酯（14.72%）和乙酸苯乙酯（5.18%）；发酵后新鲜果渣的主体酯类为2-甲基-丁酸丁酯、2-甲基-丁酸甲酯、异丁酸甲酯、己酸甲酯，其相对含量分别为12.00%、8.50%、6.68%、6.13%。发酵后干果渣的主体酯类为4-癸烯酸甲酯、2-甲基-丁酸甲酯、3-甲基-丁酸甲酯、异丁酸甲酯，其相对含量分别为10.40%、9.49%、6.16%、6.09%。发酵后新鲜果渣和干果渣中有15种酯类相同。不同酯类的呈香特性不同，在实际生产中可根据所需主要香型选用适宜的果渣的处理方式。

2.3 醇类物质

发酵前新鲜果渣和干果渣中均有包括苯乙醇、正己醇在内的3种醇类，发酵后果渣均只有苯乙醇一种醇类。分析可见，发酵过程去除了原果渣中的正己醇，增加了苯乙醇的相对含量。正己醇是一种高级醇类，含量过高具有一定毒性；苯乙醇则是香料用芳香化合物中较为重要和应用广泛的一种食用香料。因此，白地霉发酵苹果渣可以提高果渣的风味和食用安全性。

2.4 醛、酮、酸类物质

除干果渣经发酵后，丙炔酸含量有所增大以外，发酵过程去除了原果渣中的多种酸类。特别是，发酵后新鲜果渣中乙酸含量由原来的2.675降为0，发酵后干果渣中乙酸的含量由原来的10.32%降到0.90%。这说明，白地霉发酵苹果渣的过程中，这些醛、酮、酸类物质都进行了转化，特别是原有的乙酸、己酸等都被完全转化成了其它香气成分，从而有效地提高了苹果渣的风味质量。

2.5 酚、烷类及其它物质

未发酵的苹果渣中酚、烷类及其它物质的种类繁多，占总挥发性物质的40%以上，而且含有较多的C12～C17的烷烃类；发酵后而发酵后的新鲜果渣中只含有34.88%的这些物质，发酵后干果渣中仅含有18.12%的这些物质。

3 讨论与结论

3.1 讨论

研究发现，在发酵后苹果渣中均未检出乙酸乙酯。龙明华在以浓缩苹果汁为原料发酵生产的苹果酒中也未检出乙酸乙酯［23］。发酵后苹果渣中检出区别于对照中的酯类（2-甲基丁酸甲酯、己酸甲酯）和醇类（如苯乙醇）的含量都有明显提高，说明在发酵的过程中产生了区别于未发酵苹果渣中的特异性香气且能够使一些香气物质的含量有所提高，具体的机理和最适发酵条件还有待进一步的研究。

由以上分析可以发现，发酵前后苹果渣中挥发性气体的呈香特性具有显著不同。发酵后苹果渣中能够产生大量具有果香，特别是苹果香气的呈香性物质，从而说明了白地霉发酵可以有效提高苹果渣的香气浓度和香味种类，极大地提高了特征性香气成分的含量，从而有望作为天然香精的基料。

研究发现，发酵后的苹果渣中香气物质的种类和相对含量均高于未发酵的苹果渣。这说明，白地霉发酵苹果渣可以有效提高香气物质的种类和含量。与此类似，王庆国等［22］也曾发现两株能够产生果香物质的白地霉XJB45和XJA58，它们在土豆汁葡萄糖培养基中产生的香气成分主要是丁酸乙酯、异戊酸乙酯和丙酸丙酯、2-甲基-2-丁烯酸乙酯和惕各酸乙酯。而本文所得白地霉在苹果渣中所得香气成分则主要是2-甲基丙酸乙酯、乙酸乙酯和3-甲基-1-丁醇乙酸酯。造成这种差异的主要原因是研究用的微生物菌种、培养基和样品处理方法不同。此外，王国庆等在分析前是用溶剂萃取法研究培养基中的香气成分，而本文则是对所产气体成分进行直接检测。这提示我们，白地霉发酵产香与培养基和菌种的种类有关。

本研究可为白地霉进行香精或香料的生物合成提供基础依据。香料和香精的生产方法主要有化学合成法、动植物提取法和微生物发酵法。利用微生物发酵来模拟植物次级代谢过程可生产出香料化合物，而且这些香料化合物已被欧洲和美国食品法规界定为“天然的”［19］。随着社会的发展和人们生活质量的提高，人们对天然香料和香精的偏爱程度越来越高。而且与动植物提取法相比，微生物发酵法具有不受季节影响、操作简便、周期短等优势，具有广阔的发展前景［20］。

白地霉发酵苹果渣能够有效提高果渣饲料的营养和风味，提高饲料的适口性，研究为苹果渣及其他农产品废料的利用提供了另一种途径。白地霉中含有丰富的蛋白质和脂肪，可供食用及饲用。国外广泛用于生产乳酪［24-25］；国内多用酒精废水、豆腐废水、豆腐酸浆、曲酒丢糟等废弃物的发酵产生白地霉［26-29］，作为菌体蛋白使用。本研究结果发现，白地霉发酵苹果渣消除了原有果渣中的异味。

发酵苹果渣产生的香气物质组成复杂，且大多数组分含量很低，常规分析中应用溶剂萃取浓缩等技术手段会使挥发性组分损失，因而挥发性物质的检测制约着香气物质的研究。本研究采用固相微萃取技术，减少了样品处理环节且大量富集待测香气组分，极大地提高了分析的灵敏度与准确性［30］。

3.2 结论

本文研究了白地霉TF发酵苹果渣所产香气成分及其对苹果渣风味的影响，结果发现，发酵过程能够有效提高苹果渣中酯类的种类和含量，增加果渣中苯乙醇含量，同时减少醛、酮、酸、酚、烷类及其它物质的种类和含量，使苹果渣产生浓郁果香，风味得到很好的改善。

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Study on production of volatile aroma by solid-state fermentation of Geotrichum candidum in apple pomace

ZHU Jing，SHI Jun-ling*，LIU La-ping
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，China）

TS201.3

A

1002-0306（2010）10-0176-06

2009-08-03 *通讯联系人

朱静（1983-），女，在读硕士研究生，主要从事食品生物技术研究。

现代葡萄产业技术体系建设专项（z225020804）；国家自然科学基金（20862014）。