响应面法优化闪式提取陈皮中橙皮苷工艺的研究

谢 捷，曹铭希，朱兴一，王 平

（浙江工业大学药学院，制药工程教育部重点实验室，浙江杭州310014）

响应面法优化闪式提取陈皮中橙皮苷工艺的研究

谢 捷，曹铭希，朱兴一，王 平*

（浙江工业大学药学院，制药工程教育部重点实验室，浙江杭州310014）

采用响应面法对陈皮中橙皮苷的闪式提取工艺进行优化。在单因素实验的基础上，选取乙醇浓度、提取时间和液固比三个主要因素，以橙皮苷得率为响应值，用响应面分析法优化橙皮苷的闪式提取工艺。结果表明，闪式提取的最佳工艺条件为：乙醇浓度70%，提取时间2.6min，液固比42.1mL/g，闪式提取2次。在此条件下，橙皮苷得率的理论值为5.39%，实测值为5.36%，与理论值的相对误差为0.56%。与乙醇热回流法相比，橙皮苷得率提高了6.35%，提取时间大大缩短。闪式提取法是一种高效快速的提取橙皮苷的方法。

响应面，闪式提取，陈皮，橙皮苷

Abstract：Response surface methodology was applied to optimize the homogenate extraction of hesperidin from pericarpium citri reticulatae.On the base of single factor experiments，ethanol concentration，extraction time and the ratio of solvent to solid were selected as the main factors.The yield of hesperdin was used as the responsive values.The response surface method was employed to optimize the homogenate extraction of hesperidin.The results indicated that the optimum conditions were as follows：the concentration of ethanol of 70%，the extraction time of 5min，the ratio of solvent to solid of 42.1mL/g and homogenate extraction for 2 times.Under the optimum extraction conditions，the predictive yield of hesperdin was 5.39%，the average validation yield of hesperidin was 5.36%，and the relative error between them was 0.56%.Compared with heating reflux extraction，the yield using the homogenate extraction was 6.35%higher and extraction time was significantly shortened.So the homogenate extraction was efficient and rapid to extract hesperdin.

Key words：response surface methodology；homogenate extraction；pericarpium citri reticulatae；hesperidin

陈皮（Pericarpium Citri Reticultae）为芸香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮［1］，具有“理气健脾、燥湿化痰”的功效。橙皮苷是陈皮的主要活性成分之一，为白色针状晶体，化学结构为具有双氢黄酮氧苷结构［2］。研究表明，橙皮苷具有镇咳平喘［3］、抗病毒［4］、抗菌［5］、止痛［6］、抗氧化［7］等功效。目前，橙皮苷的提取主要以乙醇热回流法为主，耗时长、得率较低［8］。另外也有采用超声波辅助法提取橙皮苷，提取效果较好，但提取时间略长［9］。闪式提取是利用闪式提取器高速转动时所产生的机械剪切作用、振动作用和负压涡流，迅速地将植物细胞组织粉碎至细微粒度，从而使组织内的有效成分与溶剂充分接触，达到快速溶解和高效提取的目的［10］，具有时间短、效率高、操作简便等优点［11］。目前，有关闪式提取橙皮苷的工艺还未有报道，本文尝试将闪式提取法应用于橙皮苷的提取，并通过响应面分析法优化该工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

陈皮 购于杭州胡庆余堂药业有限公司，干燥粉碎后过30目筛；橙皮苷标准品 中国药品生物制品检定所；甲醇、乙酸 色谱纯；无水乙醇 分析纯。

DFY-500摇摆式粉碎机 上海鼎广机械设备有限公司；DZF真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；FSH22可调闪式提取器 郑州金星科技有限公司；Agilent液相色谱仪 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 橙皮苷的闪式提取 准确称取陈皮粗粉10.0g，加入一定量溶剂，在一定的乙醇浓度、提取时间、液固比和提取次数下进行闪式提取，过滤得橙皮苷提取液。

1.2.2 橙皮苷的乙醇热回流提取 准确称取陈皮粗粉10.0g，加入40倍70%的乙醇回流提取2h，重复2次，过滤得橙皮苷提取液。

1.2.3 橙皮苷含量的测定

1.2.3.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil（TM）C18（250mm ×4.6mm，5!m）；甲醇-水-乙酸（35∶61∶4），流速为 1.0mL/min，检测波长为 UV 286nm，柱温为30℃。

1.2.3.2 标准曲线的建立 精密称取橙皮苷标准品3.9mg，用甲醇溶解，并定容至25mL。分别进样5、10、15、20、25、30、35、40!L，进行 HPLC 检测。以进样量（!g）为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。回归方程为 Y=0.0006X+0.0086（R2=0.9999），线 性 范 围 为 0.0373～0.2931mg/mL。

1.2.3.3 橙皮苷得率的计算 吸取橙皮苷提取液10mL，用甲醇定容至50mL。精密吸取经0.45!m微孔膜滤过的滤液10!L，按上述色谱条件检测。根据回归方程求得橙皮苷的浓度，按下式计算橙皮苷得率：

式中：Y为橙皮苷得率，%；c为橙皮苷浓度，g/mL；v为提取液体积，mL；n为稀释倍数；m为陈皮质量，g。

1.2.4 实验方案的设计

1.2.4.1 单因素实验 通过预实验，确定对乙醇浓度、提取时间、液固比和提取次数进行单因素实验。

1.2.4.2 响应面优化实验 根据响应面分析软件提供的模型，选取对提取工艺影响较大的乙醇浓度、提取时间、液固比为自变量，橙皮苷的得率为响应值，设计三因素三水平的实验，实验因素与水平的取值见表1。

表1 响应面实验因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素对橙皮苷得率的影响

2.1.1 乙醇浓度对橙皮苷得率的影响 固定实验条件：提取时间为2.5min，液固比为40mL/g，提取次数为2次，考察乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%时对橙皮苷得率的影响，结果如图1所示。由于橙皮苷能溶于乙醇，而在水中的溶解性较差。在乙醇浓度为50%～70%时，得率随乙醇浓度的增加而增加。当乙醇浓度大于70%时，陈皮中的果胶多糖会发生凝固，阻碍了乙醇向细胞内的扩散，也影响了橙皮苷的有效溶出，因此，得率逐渐下降。本实验选择70%作为较适宜的乙醇浓度。

图1 乙醇浓度对橙皮苷得率的影响

2.1.2 提取时间对橙皮苷得率的影响 固定实验条件：乙醇浓度为70%，液固比为40mL/g，提取次数为2 次，考察提取时间分别为 0 .5、1、1.5、2、2.5、3.0min对橙皮苷得率的影响，结果如图2所示。提取时间在0.5～2.5min的范围内，高速的机械剪切作用使橙皮苷更易从基质中释放并溶解，得率随时间的增加而增加，2.5min时达到最高。此后再延长时间，由于橙皮苷在高温条件下发生分解，得率随之下降。因此，本实验选择2.5min作为较适宜的闪式提取时间。

图2 提取时间对橙皮苷得率的影响

2.1.3 液固比对橙皮苷得率的影响 固定实验条件：乙醇浓度为70%，提取时间为2.5min，提取次数为2 次，考察液固比分别为 20、30、40、50、60mL/g 时对橙皮苷得率的影响，结果如图3所示。液固比在20～40mL/g的范围内，溶剂量的增加使橙皮苷更易充分溶出，得率随之提高，液固比为40mL/g时达到最高。此后再增加液固比，橙皮苷得率几乎保持恒定。因此，本实验选择40mL/g作为较适宜的液固比。

图3 液固比对橙皮苷得率的影响

2.1.4 提取次数对橙皮苷得率的影响 固定实验条件：乙醇浓度为70%，提取时间为2.5min，液固比为

40mL/g，考察提取次数对橙皮苷得率的影响，结果如图4所示。得率随着提取次数的增加而提高，当提取2次时，基本提取完全。因此，选择2次作为最适宜的闪式提取次数，在响应面优化实验中不再作为考察因素。

图4 提取次数对橙皮苷得率的影响

2.2 响应面法优化闪式提取橙皮苷工艺

根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理和单因素实验的结果，选取对橙皮苷得率影响较大的三个因素：乙醇浓度、提取时间和液固比，采用Design-Expert7.0程序，进行响应面分析优化。分别对乙醇浓度、提取时间和液固比作如下变换：X1=（Z1-70）/10，X2=（Z2-2.5）/0.5，X3=（Z3-40）/10，橙皮苷得率Y为响应值。实验设计与实验结果如表2所示，其中1～12是析因实验，13～15是中心实验，用来估计实验误差。回归结果如表3所示。

表2 响应面分析方案及实验结果

表3 回归分析结果

该回归模型极显著（P＜0.001），表明与实际实验拟合较好。决定系数R2=99.10%，表明响应值的变化有99.10%来源于所选变量。模型失拟项P=0.4415＞0.05，不显著，表明本实验无其他因素的显著影响，回归模型可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。对响应值与各因素进行回归拟合后，得到回归方程：

一次项和二次项均对橙皮苷得率的影响显著，交互项的影响小。根据回归分析结果，得响应面及其等高线如图5～图7所示。从响应面的最高点和等高线可以看出，在所选的范围内存在极值。由图5可知，X1和X2的等高线呈椭圆形，同时橙皮苷得率对乙醇浓度的变化比对提取时间的变化敏感。由图6可知，X1和X3的等高线也呈椭圆形，且橙皮苷得率对乙醇浓度的变化比对液固比的变化敏感。由图7可知，X2和X3的等高线几乎呈圆形，提取时间和液固比的交互作用很小。综合以上分析，乙醇浓度是影响橙皮苷得率的主要因素，其次是液固比，而提取时间对橙皮苷得率影响较小。

图5 Y=f（X1，X2）的响应面和等高线

图6 Y=f（X1，X3）的响应面和等高线

图7 Y=f（X2，X3）的响应面和等高线

对回归方程取一阶偏导数并解方程组可得：X1=-0.067，X2=0.0913，X3=0.2063。代入前述的变换公式，可得橙皮苷最佳提取工艺条件为：乙醇浓度69.33%、提取时间2.55min、液固比42.06mL/g。考虑到实际情况，将最佳提取工艺条件修正为乙醇浓度70%、提取时间2.6min、液固比42.1mL/g。

2.3 最佳工艺验证

根据以上最佳条件进行橙皮苷的提取，实验重复三次，橙皮苷的实际得率为5.36%，与理论值5.39%的相对误差为0.56%，表明响应面分析法得到的工艺参数真实可靠，具有实用价值。

2.4 不同提取工艺比较

将陈皮粗粉按1.2.2中所示的提取条件进行乙醇热回流提取，并与闪式提取进行比较，结果如表4所示。

表4 不同提取工艺的比较（n=3）

与乙醇热回流提取相比，闪式提取橙皮苷的得率提高了6.35%，提取时间由2h缩短到2.5min。闪式提取利用高速机械剪切力和振动作用使植物组织迅速破碎，继而有效成分在负压渗透的作用下快速达到溶解平衡，因而提取效率得到显著提高。

3 结论

3.1 探索了橙皮苷的闪式提取工艺，并用响应面法优化得到了最佳工艺条件：乙醇浓度70%、提取时间2.6min、液固比42.1mL/g、提取2次。在此工艺条件下，橙皮苷的实际得率达5.36%，与理论值基本相符。

3.2 与乙醇热回流法相比，闪式提取橙皮苷的得率提高了6.35%，时间更短，是一种高效提取橙皮苷的方法。

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Optimization for homogenate extraction of hesperidin from pericarpium citri reticu/atae by using response surface methodology

XIE Jie，CAO Ming-xi，ZHU Xing-yi，WANG Ping*
（Zhejiang University of Technology，College of Pharmaceutical Sciences，Key Laboratory of Pharmaceutical Engineering of Ministry of Education，Hangzhou 310014，China）

TS255.1

B

1002-0306（2010）10-0285-04

2009-10-09 *通讯联系人

谢捷（1978-），女，硕士，讲师，研究方向：天然药物化学。

浙江省重大科技专项（2008C13036-3）。