响应面法优化桃金娘色素的提取工艺

张少敏，陈文芬，赵谋明

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

响应面法优化桃金娘色素的提取工艺

张少敏，陈文芬，赵谋明*

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

为得到桃金娘果实色素的最佳提取工艺条件，采用全波长扫描得出桃金娘色素的最大吸收波长和最佳提取剂及其最佳pH，在此基础上，以提取时间(A)、提取剂体积分数(B)、液料比例(C)、提取温度(D)为单因素考察因子，以最大吸收波长处的吸光值为响应值，运用响应面对其提取工艺参数进行了优化。结果表明，pH为1.0的酸化乙醇为桃金娘色素的最佳提取溶剂，且最大吸收峰λmax为520nm，响应面分析得到四个因素的最佳组合为:提取时间3.56h，乙醇浓度54.55%，液料比22.36mL/g，温度64.78℃，在该条件下色素理论最大提取值为0.6070，实际验证值为0.6177，两者误差较小，表明该条件组合较好。

桃金娘，色素，响应面，吸光值

Abstract:In order to get the optimal extraction conditions of Rhodomyrtus tomentosa pigment，full wavelength scanning was used to obtain the maximum absorption wavelength and the optimal pH of the extraction agent.The effects of extraction time，volume fraction of alcohol，material-solvent ratio and extraction temperature on absorbance were studied.Based on the single factor test，the absorbance at the maximum absorption peak as index，response surface method was used to optimize its technique parameters.The optimal condition showed as follows:the optimal extractant was acidified ethanol with pH1.0，the maximum absorption wavelength was 520nm.The optimized extraction parameters were extraction time 3.56h，54.55%(volume fraction)alcohol condition，material-solvent ratio 1∶22.36 and extraction temperature 64.78℃.Under the optimal conditions，the absorbance at the maximum absorption wavelength of pigment extract was 0.6070，the actual verification value was 0.6177 which had less errors compared with the predicted value.

Key words:Rhodomyrtus tomentosa;pigment;response surface methodology;absorbance

大多天然色素色泽纯正，安全性高，有些对人体还有一定的保健作用［1］，天然色素的研究与开发已成为国内外食品领域研究的热点。国外的食品着色剂正逐步向以天然色素为主，合成色素为辅的方向发展。我国的天然食用色素研究起步相对较晚，目前尚处于天然色素与合成色素并存的状况，但我国已把开发天然食用色素作为发展食品添加剂的一个重要方向［2］。桃金娘为桃金娘科药用植物，又称稔子、山稔，主要分布于我国南方各省，桃金娘的果实完全成熟时味甜，略有涩味，汁液呈诱人的紫红色，富含多糖、蛋白质、单宁、黄酮类、花青素、萜类化合物、氨基酸、微量元素和维生素等多类化学成分［3-4］，且有研究表明其对化脓链球菌具有抑制作用［5］，是一种难得的药膳同源新资源，具有较高的开发利用价值。目前对于桃金娘的开发利用主要集中在医药、植物资源、生态学［6］等领域，食品领域中对桃金娘果实在饮料［7-8］方面的研究较多，对其果实中的色素研究很少，而桃金娘色素具有色泽鲜亮，无毒，无异味等优点，并兼有多种营养成分，符合现代人对健康、安全理念的要求，具有广阔的开发前景。本研究在确定桃金娘色素最大吸收波长的基础上，利用响应面法优化了桃金娘色素的提取工艺，为对其深入研究和开发应用提供了指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

全熟的桃金娘果实 采于广东茂名，干燥粉碎后经80目过筛，装于封口袋密封待用;无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇、石油醚、浓盐酸等 均为分析纯。

SHZ-82A恒温振荡器 常州澳华仪器有限公司;GL-21M高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司;pHS-25数显pH计 上海精密仪器有限公司;UV-1800紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;UV-2100紫外可见分光光度计 尤尼科(上海)仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色素测定方法 我国食品添加剂标准化委员会建议采用比吸光度表示色素含量［9］。

式中:A为样品稀释至100mL时，用1cm比色皿测得最大吸收波长下的吸光度;m为样品质量，g。

由上式可以看出，当样品质量相同时，色素的比吸光度与吸光度成正比，在本实验中，样品质量相同，所以为了方便起见直接用吸光度值(A)分析比较不同提取条件下色素的提取效果。

1.2.2 桃金娘色素的提取工艺 桃金娘果实干品→粉碎→过筛(80目)→提取→离心(8000r/min)→抽滤→定容→测定吸光值

1.2.3 提取剂的选择及最大波长的确定 准确称取3.00g桃金娘粉末于锥形瓶内，以10∶1的液料比分别加入30mL的蒸馏水、0.5%盐酸-蒸馏水、0.5%盐酸-75%乙醇、75%乙醇、0.5%盐酸-75%甲醇、75%甲醇、乙酸乙酯、石油醚。在55℃下振荡提取2.0h，8000r/min离心 15min，抽滤，全部滤液定容至100mL，观察色泽差异，初步确定该色素的最佳提取溶剂，并用UV-1800紫外可见分光光度计在400～700nm的波段内扫描各提取液的最大吸收波长(λmax)，最终确定该色素的最佳提取溶剂。

1.2.4 提取剂最佳pH的确定 用盐酸将提取溶剂的 pH 分别调为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，其他操作同

1.2.3 ，在400～700nm波长范围内扫描确定提取溶剂的最佳提取pH，并对1.2.3得到的最大波长进行验证。

1.2.5 响应面设计 在单因素实验的基础上，取样品1.00g进行响应面实验并将提取液定容至50mL，以提取时间(A)、乙醇浓度(B)、液料比(C)、提取温度(D)为自变量，最大吸收波长处吸光值为响应值，设计四因素五水平的二次回归方程拟合自变量和色素吸光值之间的函数关系，采用响应面分析方法优化提取工艺。实验设计因素水平见表1。

表1 响应面设计因素水平表

表2 桃金娘色素在不同提取剂中的溶解性和色泽变化

2 结果与讨论

2.1 提取剂的选择及最大波长的确定

由表2和图1可见，乙醇和甲醇的酸性溶液更适合于作为桃金娘色素的提取溶剂，这两种提取剂得到的色素提取液具有明显的吸收峰，且均在520nm。从安全性角度考虑，选取酸性乙醇为最佳提取剂，最大吸收波长为520nm。

图1 不同提取剂中的桃金娘色素扫描吸收光谱

2.2 提取剂pH对提取效果的影响

由图2可知，由pH1.0的提取液在520nm处具有明显的吸收峰，且呈紫红色，其他pH下的吸收峰均不明显，颜色较淡，可知极酸性条件对于桃金娘色素具有明显的护色效应，为了稳定后续单因素的实验条件将提取剂pH定为1.0。

图2 不同pH的75%乙醇提取剂中色素扫描吸收光谱

2.3 单因素实验结果

由于提取时间影响色素活性物质与提取剂的充分接触，提取剂浓度影响溶剂极性，进而影响色素的溶解情况，液料比影响色素是否能最大程度的溶解出来和提取成本的节约，温度影响色素的稳定性与提取率，因此选取这4个因素进行实验，单因素结果表明:提取时间为4h、乙醇浓度为50%、液料比为20mL/g、提取温度为65℃时色素吸光值最大，提取效果最好。因此选取时间3～5h，乙醇浓度40%～60%，液料比12～28mL/g，提取温度55～75℃为响应面实验范围。

2.4 响应面实验结果

2.4.1 响应面实验设计结果与方差分析 本实验利用Design-Expert软件中的中心组合设计(CCD)选项，获得桃金娘色素提取的四因素五水平实验设计及结果，见表3。

表3 响应面分析实验设计与结果

根据表3实验结果，经回归拟合后，各实验因子对响应值的影响可通过以下回归方程表示:

色素提取液吸光值=0.58-0.011A+0.027B+0.032C+5.063×10-3D-7.444×10-3AB-4.344×10-3AC-0.016AD-2.069×10-3BC+0.023BD-0.045CD-0.020A2-0.010B2-0.017C2-0.031D2

由方差分析结果(表4)可知:F回归模型=69.47＞F0.01，p＜0.0001，方程达到极显著水平，同时 F失拟=3.01＜F0.01，P ＞0.05，模型 R2adj为 0.9706，表明该方程对实验拟合程度较好，实验误差小，可用该方程对不同提取条件下的色素提取效果进行预测。

通过回归方程系数显著性检验结果表5可知，因素A、B、C对色素提取效果影响极显著(p＜0.01)，因素D对色素提取效果影响显著(p＜0.05);四个实验因素的二次项对色素提取效果影响均为极显著(p＜0.01)，交互项中 AB对提取效果影响显著(p＜0.05)，AD、BD、CD交互项对提取效果影响极显著(p＜0.01)，表明各影响因素与响应值不是简单的线性关系。对回归方程中一次项系数的绝对值进行比较，可判断因子影响的主次性［10］，结合方差分析得到各实验因子对色素提取液吸光度的影响主次顺序为:液料比＞乙醇浓度＞提取时间＞提取温度。

依据方差分析结果，剔除不显著项，简化后的回归方程为:

色素吸光值=0.58-0.011A+0.027B+0.032C+5.063×10-3D-7.444×10-3AB-0.016AD+0.023BD-0.045CD-0.020A2-0.010B2-0.017C2-0.031D2

2.4.2 各因素间的交互作用分析 如果一个响应曲面坡度相对平缓，表明其可以忍受处理条件的变异，而不影响到响应值的大小，相反，如果一个响应曲面坡度非常陡峭，表明响应值对于处理条件的改变非常敏感［11］。本实验响应值对交互项中 AB、AD、BD、CD交互作用较为敏感，即这四个交互项方差分析结果显示显著或极显著。

由图3可知，提取时间和乙醇浓度的交互作用对色素提取效果影响显著(p=0.0198)，时间小于4h时，随着时间增大色素提取量逐渐增大，当时间大于4h以后，随着时间增大色素提取量逐渐下降;在低乙醇浓度(40%～55%)条件下，随提取剂浓度的增大，色素提取量逐渐增大，当浓度超过55%之后，随提取剂浓度增大，色素提取效果趋于平缓，并有下降趋势。

图3 提取时间和乙醇浓度的交互作用对色素提取效果的影响

由图4可知，提取时间和提取温度的交互作用对色素提取效果影响极显著(p＜0.0001)，在4.5h之内随时间增大色素提取量逐渐增大，当时间超过4.5h后随时间增大色素提取量明显降低;在低温条件下(55～65℃)，随着温度的增加色素提取量明显增大，当温度超过65℃后，随着温度的增加色素提取效果明显下降。

图4 提取时间和提取温度的交互作用对色素提取效果的影响

由图5可知，乙醇浓度和提取温度的交互作用对色素提取效果影响极显著(p＜0.0001)，在低温条件下(55～65℃)，随着乙醇浓度的增大，色素提取效果缓慢增加，当乙醇浓度超过55%之后，随着浓度的增大，色素提取效果呈明显降低趋势，在较高温度下(65～75℃)，随着乙醇浓度逐渐增大，色素提取效果始终呈现增加趋势。乙醇浓度在40%～60%范围内变化时，随着温度的增大，以65℃为转折点，色素提取量先增大后下降。

表4 色素提取回归模型方差分析表

表5 色素提取回归方程系数显著性检验结果

图5 乙醇浓度和提取温度的交互作用对色素提取效果的影响

由图6可知，液料比例和提取温度的交互作用对色素提取效果影响极显著(p＜0.0001)，在低温条件下(50～60℃)，随着液料比例的增大，色素提取效果始终呈增大趋势，在较高温度下(60～75℃)，随着液料比例的增大，色素提取效果明显下降;在小液料比(12～16mL/g)条件下，随着温度的增大，色素提取效果逐渐增大。在较大液料比(16～28mL/g)条件下，随着温度的增大色素提取效果明显下降。

图6 液料比和提取温度的交互作用对色素提取效果的影响

2.5 最佳提取条件选择与验证

运用Design-Expert处理得到四个因素的最佳组合为:提取时间3.56h，乙醇浓度54.55%，液料比22.36，温度64.78℃，在该条件下色素理论最大提取值为0.6070。为了考察该最佳条件组合的可靠性，在该条件下对色素最大提取量进行验证，考虑到实际可操作性，提取时间定为3.6h，乙醇浓度定为55%，液料比定为22mL/g，温度定为65℃对其进行验证，重复4次实验，得到的实际色素吸光值为0.6177，与理论预测值较为接近，误差为0.0176，表明该数学模型对优化桃金娘色素提取工艺的可行性较好。

3 结论

本实验采用全波长扫描得到桃金娘色素的最大吸收波长λmax为520nm，并确定pH为1.0的酸性乙醇为最佳提取试剂，采用响应面法得到桃金娘色素最佳提取工艺为:提取时间3.56h，乙醇浓度54.55%，液料比22.36mL/g，温度64.78℃。在此条件下的验证值为 0.6177，与理论预测值 0.6070较接近，误差为0.0176。

［1］周立国.食用天然色素及其提取与应用［M］.济南:山东科学技术出版社，1993.

［2］黎彧.利用天然资源开发食用色素［J］.资源开发与市场，2003(4):245-247.

［3］Hvr W H，Man M.Two new truterpenoids from rhoddmyrtus tuimentosa［J］.Phytochemistry，1976，115:1741-174.

［4］江彩华，方伟章，丁文恩，等.桃金娘保健饮料的开发研究［J］.林业实用技术，2003(6):10-11.

［5］Surasak L，Supayang P V.Boesenbergia pandurata(Roxb.)Schltr.，Eleuthe rineamericana Merr.and Rhodomyrtus tomentosa(Aiton)Hassk.As antibiol Producing and antiquorum sensing in Streptococcus pyogenes［J］.FEMS Immunology ＆ Medical Microbiology，2008，53(3):429-436.

［6］陈火君，江晓燕.桃金娘开发应用研究进展［J］.广东农业科学，2007(2):109-111.

［7］张奇志，廖均元，林丹琼.桃金娘天然保健饮料开发研究［J］.饮料工业，2008，11(20):32-34.

［8］吴文.桃金娘、枸杞、红枣保健饮料的研制［J］.饮料工业，2005，8(5):17-19.

［9］段纯明，董海洲.膨化玉米黄粉中天然黄色素的制取工艺研究［J］.食品与发酵工业，2007(3):128-132.

［10］周存山，马海乐，胡文彬.多斑紫菜多糖提取工艺的优化［J］.农业工程学报，2006，22(9):192-197.

［11］陈莉，屠康，王海，等.采用响应曲面法对采后红富士苹果热处理条件的优化［J］.农业工程学报，2006，22(2):159-163.

Optimization of extraction technique of pigment from Rhodomyrtus tomentosa by response surface methodology

ZHANG Shao-min，CHEN Wen-fen，ZHAO Mou-ming*
(College of Light Industry and Food，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

TS202.3

B

1002-0306(2010)08-0190-05

2009-12-24 *通讯联系人

张少敏(1987-)，女，硕士研究生，研究方向:食品生物技术。

国家863计划重点项目(2007AA100404);广东省科技计划项目(2008A010900003)。