GRP78在肺腺癌细胞顺铂耐药中的作用

吴晶 王琪 王佳瑞 张黎川 赵龙

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年升高趋势，而且80%的患者确诊时已丧失手术机会，因此化疗在肺癌的治疗中具有重要的作用。然而化疗耐药一直是肺癌治疗领域的热点问题，肿瘤耐药的发生与肿瘤细胞生存的微环境密切相关。由于肿瘤生长迅速，血液供应相对不足，产生了低糖、缺氧及酸中毒的微环境，这种微环境能够诱导糖调节蛋白78（glucose regulated protein, GRP78）的表达，而GRP78具有维持内质网稳定、保护细胞的作用[1,2]。钙离子拮抗剂A23187是一种Ca2+转运载体，可以破坏细胞内质网内钙离子平衡，能够诱导肿瘤细胞合成GRP78[3]。有研究[4]表明GRP78在肿瘤细胞中呈现高表达，并与肿瘤细胞对化疗药物的耐药性有关。我们曾对大细胞肺癌、小细胞肺癌中GRP78的表达与VP-16耐药之间的相关性进行了研究[5,6]。但关于GRP78在肺腺癌中的表达情况及其表达是否与腺癌细胞对化疗药物顺铂的耐药具有相关性，目前国内外研究较少。本研究旨在通过对在诱导剂A23187作用下肺腺癌细胞SPCA-1中GRP78表达水平的检测及其表达与肺癌细胞对顺铂耐药的相关性的分析，探讨GRP78在肺腺癌对顺铂耐药中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人肺腺癌SPCA-1标准细胞株，购于中科院细胞研究所。

1.1.2 试剂 RPMI-1640培养液、A23187、顺铂、Trizol（Sigma产品），RT-PCR试剂盒、DNA Marker DL2000（Takara产品），羊抗人GRP78抗体、羊抗人β-actin抗体、HRP-兔抗羊IgG（Santa Cruz公司），ECL试剂盒（Amershan公司），MTT（Amresco公司），DMSO 、A23187、顺铂（Sigma公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 SPCA-1细胞株复苏后培养于RPMI-1640培养基中，置于5%CO2、饱和湿度37oC的孵箱中培养。将5×104个细胞接种于25 mL的培养瓶中培养24 h后，再将细胞分为实验组与对照组，实验组加入不同浓度A23187（1 μM、2 μM、4 μM、6 μM）；对照组加入PBS，培养24 h。

1.2.2 RNA提取以及RT-PCR 按试剂盒说明分别提取实验组和对照组细胞的总RNA，制备cDNA，进行PCR产物扩增。GRP78 mRNA上游引物序列为5' GATAATCAACCAACTGTTAC 3'，下游引物序列为5' GTATCCTCTTCACCAGTTGG 3'，预计扩增片段长度为577 bp；内参β-actin上游引物序列为5'TCGTCACCAACTGGGACGACATGG 3'，下游引物序列为5' GATCTTGATCTTCATTGTGCTGGG 3'， 预计扩增片段长度为750 bp。PCR循环参数：94oC预变性4 min，94oC变性1 min，58oC退火30 s，72oC 延伸30 s，30个循环，72oC再延伸10 min。PCR反应体系为：cDNA 2 μL、PCR引物各1 μL、5×PCR Buffer 10 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、dNTP混合物1 μL、Taq酶0.25 μL。取PCR扩增产物10 μL，于1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，用美国UVP凝胶成像系统EC3 System进行扫描分析，计算公式为：某样品GRP78 mRNA的相对表达水平=样品GRP78的IOD值/样品β-actin的IOD值。

1.2.3 蛋白提取及Western杂交 将细胞置于1.5 mL Eppendorf管中，加入RIPA缓冲液300 μL，以12 000 rpm速度、4oC离心10 min，将上清转移至新管，再重复离心2次，-70oC保存；Kobayashi等[7]使用Bradford比色法测定蛋白含量，依次进行SDS-PAGE、电转印。取下转印好的PVDF膜，放入封闭液中4oC封闭过夜，加入稀释的羊抗人GRP78抗体（一抗，1:400）及羊抗人β-actin（一抗，1:400）， 37oC孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min。再加入稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG（二抗，1:5 000），37oC孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，在室温进行ECL显色。用美国UVP公司EC3 System凝胶成像系统对PVDF膜进行扫描分析，计算公式为：某样品GRP78蛋白的相对表达水平=样品GRP78的IOD值/样品β-actin的IOD值。

1.2.4 MTT比色法 取对数生长期的实验组和对照组SPCA-1细胞，用RPIM-1640培养基制成单细胞悬液，按1×104个/孔接种于96孔培养板，每孔加200 μL培养基，置于5 %CO2、饱和湿度的37oC孵箱培养24 h。然后，加入不同浓度的顺铂（0 μM、2 μM、4 μM、6 μM、8 μM），每个浓度设1个主孔2个副孔，继续培养48 h后，再向各孔加入MTT 20 μL，4 h后加DMSO溶解甲臢，在酶标仪上选择波长490 nm，检测各孔OD值，计算细胞生存率及IC50。细胞生存率=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值-空白对照组OD值）×100%；IC50：使用Bliss法计算；耐药指数（resistance index, RI）=IC50实验组/IC50对照组。

1.3 统计学处理 所有实验均重复3次以上，实验数据用MEAN±SD表示，采用 SPSS 12.0软件处理，用单向方差分析比较多组间均数的差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌SPCA-1细胞中GRP78核酸水平的表达 RT-PCR结果显示：对照组GRP78核酸的相对表达量为0.165±0.007 3；实验组中，当A23187浓度为1 μM-6 μM时，GRP78核酸的相对表达量分别为0.495±0.030、0.604±0.031、0.705±0.046 和0.890±0.046；与对照组相比，其表达水平明显增高（P＜0.05），并呈现一定的A23187浓度依赖性（图1）。

2.2 肺腺癌SPCA-1细胞中GRP78蛋白水平的表达 Western杂交结果显示：对照组GRP78蛋白的相对表达量为0.304±0.003；实验组中，当A23187浓度为1 μM-6 μM时，GRP78蛋白的相对表达量分别为0.545±0.004、0.763±0.012、0.864±0.023和0.892±0.034。与对照组相比，其表达水平明显增高（P＜0.05），并呈现一定的A23187浓度依赖性（图2）。

2.3 细胞生存率与GRP78表达的相关性 不同浓度A23187诱导下细胞对顺铂的IC50值。对照组IC50为5.73±0.43；实验组中，当A23187浓度为1 μM、2 μM、4 μM、6 μM时，其IC50值分别为：7.06±0.37、4.23±0.17、3.84±0.32和3.03±0.24。可见在相同浓度顺铂作用下，当A23187浓度为2 μM、4 μM、6 μM时，其所对应的细胞生存率明显低于对照组（P＜0.05），且其降低呈现一定的A23187浓度依赖性。结合前述GRP78在核酸和蛋白水平表达的特点，即A23187对GRP78的表达呈浓度依赖性诱导，提示肺腺癌细胞对顺铂的耐药性与GRP78表达呈负相关（图3）。

图 1 不同浓度A23187诱导下SPCA-1细胞GRP78核酸水平的表达Fig 1 Expression of GRP78 mRNA in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrationsA: RT-PCR results of GRP78 mRNA in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrations (0 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 6 μM) for 24 h; B: Bar graph showing the relative level of GRP78 mRNA evaluated using the ratio of IODGRP78/IODβ-actin. Data represent mean values and bars indicate the SD of triplicate determinations.*P＜0.05 compared to the control.

图 2 不同浓度A23187诱导下SPCA-1细胞GRP78蛋白水平的表达Fig 2 Expression of GRP78 protein in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrationsA: Western blot results of GRP78 protein in SPCA-1 cells exposed to A23187 at different concentrations (0 μM, 1 μM, 2 μM, 4 μM, 6 μM) for 24 h; B: Bar graph showing the relative level of GRP78 protein evaluated using the ratio of IODGRP78/IODβ-actin. Data represent mean values and bars indicate the SD of triplicate determinations.*P＜0.05 compared to the control.

图 3 不同浓度A23187诱导下的SPCA-1细胞对顺铂的生存曲线Fig 3 Survival curves of SPCA-1 cells to cisplatin after being induced by A23187 at different concentrations

3 讨论

GRP78具有促进错误折叠蛋白恢复正常构象、维持内质网和胞质Ca2+平衡并调节内质网内Ca2+依赖性蛋白修饰反应、对抗氧化应激，从而保护细胞的作用[8]。各种应激条件如葡萄糖缺乏、蛋白错误折叠、蛋白糖基化及一些诱导剂（如Ca2+-ATPase抑制剂thapsigargin）都可以激活GRP78转录基因，诱导产生GRP78[3,9,10]。近年来的研究[11]发现应激条件下细胞合成和高度表达GRP78的反应，可能是细胞的一种重要防御机制。该机制对细胞具有保护作用，能够延长在各种不利因素刺激下的细胞生存期[12-14]。而且，GRP78在一些肿瘤细胞中呈高表达，对肿瘤细胞的耐药性有一定影响。

A23187是一种Ca2+转运载体，作用于细胞后，可使细胞内质网Ca2+浓度（[Ca2+]ER）下降，胞质内Ca2+浓度（[Ca2+]c）增加。因而，可以造成内质网Ca2+失衡，产生内质网应激反应，激活GRP78基因，诱导产生GRP78[3]。已有研究发现A23187 可以诱导人大细胞肺癌细胞NCI-H460及人小细胞肺癌细胞NCI-H446 GRP78的表达[5,6]。本研究表明：A23187也可以明显诱导人肺腺癌SPCA-1细胞GRP78在蛋白及核酸水平的表达。

顺铂属细胞周期非特异性药物，其抗癌谱广，自70年代开始用于临床以来，已成为治疗肺癌、食管癌、恶性淋巴瘤、卵巢癌等多种恶性肿瘤的一线化疗药物。 本实验的结果显示，当A23187浓度为2 μM、4 μM、6 μM时，SPCA-1细胞中GRP78的表达明显升高，相应的细胞在顺铂作用下的生存率却明显降低，表明A23187诱导下的GRP78高表达与SPCA-1细胞顺铂耐药呈现负相关性，即GRP78高表达能够提高肺腺癌细胞对顺铂的敏感性。Mese等[15]通过对人表皮细胞癌的研究发现，GRP78表达增高能够提高野生株A431细胞对顺铂的敏感性，而对耐药株A431/CDDP2细胞没有影响。Belfi等[16]利用实验证明人结肠癌细胞HCT116、SW480与VACO-8中GRP78的表达增高，可以增强结肠癌细胞对顺铂的敏感性。Satadal等[17]通过对中国仓鼠V79细胞的研究发现，在两种诱导剂6-氨基烟碱与2-脱氧葡萄糖的作用下，GRP78的表达水平均明显增高，与此相对应，V79细胞对顺铂的敏感性亦明显增强。顺铂主要通过与DNA分子形成链内或链间交叉联接或阻止RNA分子再复制等途径发挥抗肿瘤药理作用，GRP78高表达能够提高细胞对顺铂的敏感性的机制主要与DNA交联修复有关。一方面，GRP78能够减慢DNA交联产物从细胞内脱失的速度；另一方面，GRP78还能够削弱DNA加和物切补修复，从而导致DNA交联产物在细胞内滞留时间延迟，增强药物的敏感性[17]。

当然，肺癌细胞对顺铂的耐药是多因素多因子共同参与的复杂过程，除了细胞微环境中的GRP78的作用以外，其它机制如药物流入减少或流出增加、与谷胱甘肽或金属硫蛋白结合、机体对药物的解毒作用增强、DNA修复以及DNA复制损伤等也与此相关。因此，肺癌顺铂耐药机制值得进一步研究。