3种海洋微藻多糖提取工艺的研究

刘筱潇，孙颖颖，管习超，王长海

(1.淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港222005；2.烟台大学海洋学院，山东 烟台264005；3.大连理工大学环境与生命学院，辽宁 大连116024)

3种海洋微藻多糖提取工艺的研究

刘筱潇1，孙颖颖1，管习超1，王长海2,3

(1.淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港222005；2.烟台大学海洋学院，山东 烟台264005；3.大连理工大学环境与生命学院，辽宁 大连116024)

采用热水浸提法，通过一系列单因素试验，研究了提取时间、pH、温度和液料比对四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻等 3种海洋微藻多糖提取的影响。在此基础上，通过正交试验进一步优化多糖的提取工艺。最后，采用适宜提取工艺制备 3种海洋微藻粗多糖样品，并测定样品蛋白质和多糖含量。单因素结果表明，提取时间、pH、温度和液料比均能影响四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻多糖的提取。其中，提取时间显著影响新月菱形藻多糖的提取，提取pH对四爿藻和新月菱形藻多糖的提取有显著影响，而提取温度和料液比均能显著影响 3种海洋微藻多糖的提取。正交试验结果表明，四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻粗多糖提取的适宜提取时间，温度，pH和料液比分别为80℃、60℃、80℃，240 min、240 min、120 min；10、10、10；1:15、1:25、1:25。制备的粗多糖样品中蛋白质和多糖含量分别为 0.59%、0.76%、1.50%和 51.4%、17.2%、13.5%。很低的蛋白质含量和较高的多糖含量，表明采用上述试验确定的提取工艺获得的粗多糖样品纯度较高，利于样品的后续分离纯化。

多糖；海洋微藻；热水浸提；提取工艺

Abstract:Aiming at the extraction of polysaccharide from Tetraselmis elliptica,Nitzschia closterium and Phaeodactylum triconutum with hot-water immersed method,experiment factors and levels were firstly selected by single-factor tests in this paper.4 factors of extraction included extraction time,extraction pH,extraction temperature and ratio of water to material.On this basis,extraction process of polysaccharide was optimized further by orthogonal experiments.Finally,prepared crude polysaccharide samples using the suitable extraction process,and determined of protein and polysaccharide contents of those samples.The results showed that the extraction time,extraction pH,extraction temperature and the ratio of water to material could affect the polysaccharide extraction of the three species of the marine microalgae.And the extraction time had significant effect on the polysaccharide extraction of N.closterium,and the extraction pH could significantly affect the polysaccharide extraction from T.elliptica and N.closterium,and the extraction temperature and the ratio of water to material had strongly effects on the polysaccharide extraction from three species of the marine microalgae.Orthogonal experimental results showed that the appropriate extraction process of polysaccharide from T.elliptica,N.closterium and P.triconutum as follows: extraction temperature,extraction time,extraction pH and liquid feed ratio were 80℃,60℃,80℃; 240min,240min,120min; 10,10,10; 1:15,1:25,1:25,respectively.The protein and polysaccharide content of polysaccharide samples were 0.59%,0.76%,1.50%,and 51.4%,17.2%,13.5%,respectively; very low protein content and higher content of polysaccharide,indicating that adoption of these experiments to determine the extraction process of crude polysaccharides was higher purity sample,the follow-up samples in favor of the separation purification.

Keywords:polysaccharide; marine microalgae; hot-water immersed; extraction process

海洋微藻多糖是海洋微藻的生物活性物质之一。近年来，随着海洋药物的兴起，人们逐渐发现海洋微藻多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射和降血糖等活性功效，其作为药物和药物中间体的研究已成为药物研究的重点[1]。Hayashi等用热水从螺旋藻（Spirulina sp.）中提取的新型硫酸多糖（Ca-SP）具有显著的抗病毒活性[2,3]。Fabregas等发现盐藻（Dunaliella salina）的硫酸化多糖在体内对败血症病毒（VHSV）和非洲猪热病毒（ASFV）的复制有抑制作用，尤其在抗肿瘤方面，盐藻多糖复合物能明显抑制实体瘤 S180的生长，其抑制率高达 60%以上[4]。顾宁琰等研究了紫球藻（Porphyridium cruentum）胞外多糖在体内对小鼠免疫功能的调节作用，发现此多糖能显著提高小鼠脾细胞增殖水平、NK细胞杀伤活性和 IL-2活性[5]。吴洁等指出，极大螺旋藻胞外多糖（EPⅡ）具有提高小鼠NK细胞杀伤活力[6]。鲍康德等发现，海洋浮游硅藻胞外多糖具有抗K562肿瘤细胞、抗VHSV和ASFV病毒以及免疫调节作用等多种药理活性[7,8]。四爿藻（Tetraselmis elliptica）多糖对小鼠体内黑色素瘤的抑制作用也被报道[9]。由于海洋微藻的生长条件和环境特点决定了其具有一些有别于陆生植物多糖的结构和功能，因此，加快海洋微藻多糖的开发可以弥补陆地植物多糖及海藻多糖药用特性的不足。

然而，目前对海洋微藻多糖的研究远不及陆地植物和大型藻类多，国内此类研究报道较少，且主要集中在多糖的抗肿瘤、抗病毒、抗辐射和提高免疫力等活性研究方面[2-9]，而较少报道海洋微藻多糖的提取工艺[10-13]。本文选用水产养殖业常用的3种饵料微藻-四爿藻（Tetraselmis elliptica）、新月菱形藻（Nitzschia closterium）和三角褐指藻（Phaeodactylum triconutum），采用热水浸提法，通过一系列的单因素试验和正交试验，分析温度、提取时间、pH和液料比4个因素对3种海洋微藻多糖提取的影响，获得多糖的最佳提取工艺，以期为深入开展海洋微藻多糖的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻由中国海洋大学提供，经进一步分离纯化后由烟台大学海洋生化工程研究所保存。

1.2 3种微藻藻粉的制备

3种微藻分别置于40 L光照平板生物反应器中通气培养，通气量2.0 L/min，温度(23±2)℃，光照强度 3000lx，f/2培养基[14]。培养 10d后，离心，收集藻细胞，采用冷冻干燥法制备成藻粉。

1.3 3种微藻多糖提取的单因素试验

0.2 g藻粉，按照实验设计（见1.3.1-1.3.4）提取多糖。提取后，离心，上清液经3倍体积乙醇沉淀和3% TCA除蛋白后，沉淀，洗涤，获得粗多糖。

1.3.1 温度对3种微藻多糖提取的影响 温度分别设定为 50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃，pH10，料液比（g/mL）1∶25，提取时间240 min。

1.3.2 提取时间对3种微藻多糖提取的影响pH10，料液比1∶25，温度80 ℃，提取时间分别设定为 60 min、120 min、180 min、240 min、300 min和360 min。

1.3.3 pH对3种微藻多糖提取的影响 pH依次为 6、7、8、9、10和11，料液比1∶5，温度80℃，提取时间240min。

1.3.4 料液比对3种微藻多糖提取的影响 设定pH10，温度80 ℃，提取时间240 min，料液比依次为 1∶10、1∶5、1∶20、1∶25、1∶30 和 1∶35。

1.4 正交试验

在单因素试验基础上，按照4因素3水平进行L9(34)正交试验，进一步分析提取时间、pH、温度和料液比对多糖提取的影响，因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factor levels of orthogonal experiment

1.5 蛋白质和多糖的测定

采用正交试验获得的适宜提取工艺制备3种海洋微藻粗多糖。用适量蒸馏水溶解样品后，分别采用考马斯亮蓝法和蒽酮比色法[15]测定可溶性蛋白质和多糖的含量。

1.6 数据处理

试验数据采用 SPSS11.5软件包进行独立样本检验统计分析，以 P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。

粗多糖提取率为粗多糖质量与藻粉或胞外物质量的百分比。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 温度对 3种海洋微藻粗多糖提取的影响由图1可知，温度对四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻的粗多糖提取率的影响类似。在一定温度范围内，3种海洋微藻粗多糖提取率随温度的升高而显著（P ＜0.05）增大，均在80℃温度时达到最大值，此时，四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻的粗多糖提取率分别为 50℃时粗多糖提取率的 1.9倍、2.0倍和1.5倍。当温度继续升高时，3种海洋微藻粗多糖提取率均出现下降的趋势，但仍然高于低温条件下的粗多糖提取率。此外，实验中发现，温度越高，制备的粗多糖样品色泽越深，我们认为这可能是在碱性条件下高温易导致多糖降解，从而致使粗多糖样品颜色较深[8,10]。

2.1.2 提取时间对3种海洋微藻粗多糖提取的影响从图2可以看出，提取时间在60～180 min范围内，四爿藻粗多糖提取率随提取时间的增加而增大，在180 min时粗多糖提取率达到最大值，为60 min时粗多糖提取率的1.34倍。随后，当提取时间继续增大时，粗多糖提取率开始下降；并且提取时间超过300 min时，粗多糖提取率甚至低于60 min时的粗多糖提取率。对新月菱形藻而言，提取时间在60～300 min范围内，粗多糖提取率随提取时间的增加而显著（P ＜0.05）增大，300 min时粗多糖提取率为60 min时粗多糖提取率的2.17倍。当提取时间继续增大时，新月菱形藻粗多糖提取率稍有下降，其数值为60min时粗多糖提取率的1.84倍。提取时间对三角褐指藻粗多糖提取的影响类似于其对四爿藻粗多糖提取的影响；在120 min时，三角褐指藻粗多糖提取率达到最大值，为60 min时粗多糖提取率的1.34倍。

图1 温度对3种海洋微藻粗多糖提取率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the polysaccharide extraction rate of three species of marine microalgae

图2 提取时间对3种海洋微藻粗多糖提取率的影响Fig.2 Effects of extraction time on the polysaccharide extraction rate of three species of marine microalgae

上述结果表明，提取时间能够影响3种海洋微藻粗多糖的提取，尤其能显著影响新月菱形藻粗多糖的提取。四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻粗多糖的适宜提取时间分别为 180 min、300 min和120 min。在热水浸提法中，适当延长提取时间利于微藻胞内多糖的充分溶出，从而在一定时间范围内微藻的粗多糖提取率随提取时间的增加而增大。然而，提取时间过长，则会引起多糖的降解，致使粗多糖提取率下降[12,13]（图2）。在本文后续实验中，综合考虑简化实验操作和降低能耗，将3种海洋微藻粗多糖的提取时间设定为240 min。

2.1.3 pH对3种海洋微藻粗多糖提取的影响 图3表明，碱性 pH更利于四爿藻多糖的提取。当 pH在6-10的范围内，四爿藻粗多糖提取率随pH的增大而显著（P ＜0.05）增加，并于pH10时达到最大值，其数值为pH6提取率的2.73倍。当pH继续增大时，粗多糖提取率开始下降，但仍高于pH6时的粗多糖提取率。pH从6升高至9的过程中，随着pH的增大新月菱形藻和三角褐指藻的粗多糖提取率也随之增加，在pH9时达到最大值。当pH继续增大时，新月菱形藻粗多糖提取率出现明显的（P＜0.05）下降，pH11时粗多糖提取率比pH6时的粗多糖提取率降低了61.5%；而三角褐指藻的粗多糖提取率并未发生明显降低现象，其数值仍然高于pH6时的粗多糖提取率。

图3 pH对3种海洋微藻粗多糖提取率的影响Fig.3 Effects of extraction pH on the polysaccharide extraction rate of three species of marine microalgae

比较发现pH对四爿藻和新月菱形藻的粗多糖提取有显著（P ＜0.05）的影响。并且偏碱性pH下3种海洋微藻的粗多糖提取率高于酸性pH时的粗多糖提取率，分析其原因：这可能是因为微藻多糖中有一部分酸性多糖，它们随提取液碱性的增强而更易被溶出。另外，多糖与蛋白质等物质之间可能会以非共价键形态结合在一起，在偏碱性条件下，蛋白质等易被溶解，从而将多糖释放出来

[12,13,16]。然而，pH也不能过高，这是因为在热碱环境下有一部分多糖可能被降解，从而导致粗多糖提取率的下降（pH11时新月菱形藻的粗多糖提取率非常低）。综上所述，四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻粗多糖的适宜pH分别为10、9和9。为了统一后续单因素实验操作，故将3种海洋微藻粗多糖的pH定为10。

2.1.4 料液比对 3种海洋微藻粗多糖提取的影响料液比显著地（P ＜0.05）影响了四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻粗多糖的提取。料液比从1:10增大到1:25过程中，四爿藻粗多糖提取率随液体用量增加而显著（P ＜0.05）增大，当料液比为 1:25时，粗多糖提取率最大，其数值为1:10料液比下粗多糖提取率的3.0倍；当提取液用量继续增加时，粗多糖提取率开始下降，但下降趋势并不显著（P ＞0.05）。对新月菱形藻而言，料液比为1:15、1:20和1:25时，粗多糖提取率均较大，其值分别为1:10料液比的粗多糖提取率的2.4倍、1.8倍和1.6倍；当提取液用量继续增加时，粗多糖提取率有所下降，但仍然高于1:10料液比时的粗多糖提取率。料液比对三角褐指藻粗多糖提取率的影响类似于其对四爿藻粗多糖提取率的影响，即当料液比从1:10增大到1:25过程中，三角褐指藻粗多糖提取率随提取液用量的增加而增大，并于1:25料液比时达到最大值；当提取液用量继续增加时，粗多糖提取率稍有下降。

图4 料液比对3种海洋微藻粗多糖提取率的影响Fig.4 Effect of ratio of water to material on the polysaccharide extraction rate of three species of marine microalgae

上述结果表明，在本实验中1:25（或1:15）料液比所提供的提取液用量足够四爿藻和三角褐指藻（或新月菱形藻）多糖的溶出。提取液用量过低，不利于多糖的溶出，并且无法有效降低蛋白质的浓度，致使脱蛋白过程中，蛋白质沉淀吸附多糖，造成多糖损失[4]；而过高的提取液用量，对多糖的溶出无明显增加的效果[7]，并且由于增加了下游浓缩工艺的负担，会致使粗多糖提取率有所下降。

2.2 正交试验结果

在单因素试验基础上，采用 L9(34)正交设计进一步分析温度、pH、提取时间和液料比对3种海洋微藻多糖提取的影响，结果分析见表 2。通过表 2的直观分析可知，四爿藻粗多糖提取的最佳条件为提取温度80℃、提取时间240 min、pH10和料液比1:15，在正交表中未见此试验组合（2321组合）。采用追加实验，将其与正交表中第6组实验做比较。追加实验结果表明，2321组合获得的粗多糖提取率高于第6组实验。鉴于此，四爿藻粗多糖的适宜温度、提取时间、pH和料液比分别为80℃、240 min、10和1:15。新月菱形藻适宜的温度、提取时间、pH和料液比分别为60℃、240 min、10和1:25，但正交表中同样未见此试验组合（1322组合），因此，采用追加实验与正交表中的第2组实验做比较。结果表明，1322试验组合获得的粗多糖提取率高于第2组实验。因此，新月菱形藻粗多糖适宜提取条件为温度60℃、提取时间240 min、pH10和料液比1:25。对于三角褐指藻而言，粗多糖适宜的温度、提取时间、pH和料液比分别为80℃、120 min、10和1:25，为正交表中第4组实验。

同时，比较极差发现，温度、提取时间、pH和料液比对3种海洋微藻粗多糖提取率的影响顺序不同：pH＞提取时间＞料液比＞温度（四爿藻）；pH＞温度＞提取时间＞料液比（新月菱形藻）；温度＞提取时间＞pH＞料液比（三角褐指藻）。这就表明，不同种属海洋微藻多糖提取存在差异[17,18]。

2.3 样品蛋白质和多糖含量的测定

四爿藻、新月菱形藻和三角褐指藻粗多糖样品中蛋白质和多糖的含量分别为0.59%、0.76%、1.50%和51.4%、17.2%、13.5%。

表2 正交试验结果Tab.2 Results of orthogonal test of microelement and direct analysis

3 结 论

利用单因素试验和正交试验获得3种微藻粗多糖的适宜提取时间，温度，pH和料液比分别为240 min、240 min、120 min；80 ℃、60 ℃、80 ℃；10、10 和 10；1∶15、1∶25、1∶25。随后，采用适宜提取工艺制备的3种微藻粗多糖样品中蛋白质含量很低，而多糖含量较高，表明采用上述试验确定的提取工艺获得的粗多糖样品纯度较高，利于样品的后续分离纯化。

[1]王安利,胡俊荣.海藻多糖生物活性研究新进展 [J].海洋科学,2002,26(9): 36-39.

[2]Haysahi K,Haysahi T,Kojima I.A natural sulfated polysaccharide,calium spirulan,isolation from Spirulina platensis: in vitro and in vivo evaluation of anti-herps simp lex virus and anti-humanimmunodeficiency virus activities [J].AIDS Res Hum Retr,1996,12(15): 1463-1471.

[3]Haysahi T,Haysahi K.Calcium Spirulina,an inhibitor of enveloped virus replication,from a blue-green alga Spirulina [J].Natural Product,1996,59(1): 83-87.

[4]Fabregas J,Garcia D,Fernandez-Alonso M.In vitro inhibition of the replication of haemorrhagic septicaemia virus (VHSV)and African swine fever virus (ASFV)by extracts rom marine microalgae [J].Antiviral Res,1999,44 (1): 67-73.

[5]顾宁琰,刘宇峰.紫球藻胞外多糖抗辐射的生物学活性研究 [J].海洋科学,2002,26(12): 53-56.

[6]吴洁,张成武,刘义峰,等.极大螺旋藻胞外多糖 EPⅡ的分离、纯化及免疫学研究 [J].药物生物技术,1999,6(2): 99-102.

[7]鲍康德,张小平,郑维发.海洋浮游硅藻胞外多糖研究进展 [J].安徽师范大学学报: 自然科学版,2005,28(2): 214-217.

[8]郑维发,陈才法,鲍康德,等.新月菱形藻胞外多糖的成分及其硫酸酯的制备 [J].中草药,2005,36(12): 1790-1793.

[9]刘艳,杨海波,赵莲华,等.四爿藻多糖的分离分析及其生物活性的初步研究 [J].生物技术,2007,17(2): 53-56.

[10]王长海,温少红,鞠宝.紫球藻多糖的提取和测定 [J].中国海洋药物,1999,18(1): 22-25.

[11]张新宇,王雷,李光友,等.绿色巴夫藻硒多糖的提取、分离与纯化 [J].海洋与湖沼,2000,31(6): 643-646.

[12]徐锡莲,童微星,雷引林,等.盐藻胞外多糖分离纯化方法研究[J].食品与生物技术学报,2007,26(4): 28-33.

[13]戴军,尹鸿萍,汤坚.杜氏盐藻多糖提取工艺的优化 [J].食品与发酵工业，2007,3(3): 123-127.

[14]Guillard R R L,Ryther J H.Studies of marine planktonic diatom.I.Cyclotella nana H.and Detonula confervacea (Cleve)Gran [J].Can J M,1962,17(8): 309-314.

[15]浦寅芳,孙颖颖,严军威.不同环境因子对球等鞭金藻胞内和胞外多糖合成的影响 [J].淮海工学院学报,2008,17(4): 61-64.

[16]张新宇,王雷,李光友,等.绿色巴夫藻硒多糖的提取、分离与纯化 [J].海洋与湖沼,2000,31(6): 643-646.

[17]陈峰,姜悦.微藻生物技术 [M].北京: 中国轻工业出版社,1999: 240-272.

[18]李亚清,杨海波,刘艳,等.小球藻多糖的分离纯化和组成分析[J].大连水产学院学报,2006,21(3): 294-296.

Study on the extraction process of polysaccharide from three species of marine microalgae

LIU Xiao-xiao1,SUN Ying-ying1,GUAN Xi-chao1,WANG Chang-hai2,3

(1.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China;2.School of Ocean,Yantai University,Yantai 264005,China;3.School of Environmental and Biological Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China)

Q946.3

A

1001-6932(2010)05-0534-06

2009-12-06；

2009-12-25

连云港市科技发展计划（工业攻关）项目（CG0803-1）；“十一五”科技支撑计划重大项目（2006BAD09A01）

刘筱潇（1988－），女，本科生，主要从事海洋生化工程研究。电子邮箱：syy-999@163.com

孙颖颖，电子邮箱：syy-999@163.com