淋巴细胞核化学染色表面分析

李大东杨兴林

1(浙江海洋学院医学院，舟山 316004)2(贵阳市第五医院，贵阳 550001)

淋巴细胞核化学染色表面分析

李大东1*杨兴林2

1(浙江海洋学院医学院，舟山 316004)2(贵阳市第五医院，贵阳 550001)

将图像纹理特征和物质含量测量参数—光密度值等结合起来，组成一种新的特征向量，用于分析肝癌、肝硬化时淋巴细胞化学染色核图像的微小变化。通过改进血液涂片载体，以利于提高光密度值的精度和核纹理分析。采用小波变换结合经验模式分解获取图像表面纹理特征，再与多种图像光密度值和图像能量等结合，构成一种图像组合特征多维向量，用支持向量机完成分类识别。实验结果表明，该法较好地区别了正常人与肝硬化、肝癌病人以及肝硬化与肝癌病人的外周血淋巴细胞。分析了淋巴细胞核中核酸、蛋白质等与核表面纹理及化学着色之间的关系。解决了淋巴细胞核染色表面微小变化人眼不能定量区分识别的困难。图像组合特征多维向量可以有效地反映不同淋巴细胞核表面间的纹理差异，可作为识别淋巴细胞核染色表面变化新的特征量。

图像处理;小波变换;淋巴细胞;核酸

Abstract:An eigenvector，composed by the image texture features，the optical density and image energy，was applied to analyze slight changes after lymphocyte staining on lymphocyte nucleus images of liver cancer and hepatocirrhosis patients.Improved slide of blood smear was used to enhance the precision of optical density and nuclear texture analysis.The wavelet transformation and the empirical mode decomposition were combined to obtain the image surface texture feature.The texture features，the image optical density and the energy were composed as a multi-dimensional vector，and the pattern recognition was performed with support vector machines.The experimental result showed the proposed method could distinguish normal and hepatocirrhosis，liver cancer patient′s lymphocyte with high accuracy.It was demonstrated that image feature multi-dimensional vectors were able to differentiate with different type of lymphocyte nucleus texture surfaces efficiently，and were promising in the recognition of lymphocyte changes in the nucleus of lymphoeytes staining as new features.

Key words:image processing;wavelet transformation;lymphocyte;nucleic acid

引言

将血液涂制在载玻片上，经相应化学染料染色后，在显微镜下可见各种血细胞的核表面呈现一定的颜色结构和各种表面纹理结构。对细胞核表面纹理结构而言，可以说是由紧密交织在一起的单元构成的某种结构。纹理图像的局部区域内呈现不规则性，而在整体上表现出某种规律性［1］。因表面纹理是物体内在物质结构的一种反映，所以分析细胞核表面结构，可以获得细胞内部重要的生命活动信息。使用Wright、Giemsa等染色方法对血细胞进行化学染色后，再根据血细胞形态学完成对血细胞的分类计数(如白细胞分类计数)是临床医学中一些疾病的辅助诊治手段。血液中各种血细胞经染色后，细胞核表面纹理反映了核染色质的排列状态。正常情况下，不同类型的细胞和同类型的细胞在不同分化阶段，都有不同的核纹理结构，如细网状、细沙粒状、紧密条块状等。而当细胞受病理影响时，核染色质则会出现轻微排列紊乱、方向性发生稍许改变、染色质略为变粗、出现微细裂纹以及细胞黏附异常等肉眼不易观察到的细微改变。因此可以说，细胞核表面纹理的变化为疾病的诊断及治疗观察提供了重要的分析依据。但是，目前疾病过程中血细胞核的这些细微变化，作为重要的生物信息，在白细胞分类计数这类检查方法中没有被充分利用起来，完全白白浪费了，究其原因则是由于人眼对色彩、粗糙度等分辨能力的局限性所致［2］，对其细胞核表面的细微变化(如颜色、粗糙度、粒度、网度和染色质方向性等)则根本不能进行量化分析。同时人眼的观察识别还带有很大的主观性和随意性，因而准确性和重复性差［3］。有经验的检验医师之间的辩识结果往往还存在着分歧。因此应用计算机图像处理和识别技术对血细胞核表面进行分析，给出一定的客观量化数据进行分类识别，对疾病的诊断和治疗观察具有十分重要的意义。

血细胞化学染色结果与血细胞核表面纹理结构直接相关。但是，目前大多数血细胞染色方法的基本原理至今仍未彻底搞清楚。通常认为细胞着色有些可能是物理因素，有些可能是化学因素，有些则可能是两种机制都起作用。但实质上大多数细胞染色法的基本染色物质是 DNA、RNA、蛋白质等生命单元，所以染料与生命单元间作用涉及到一门新兴的学科——生物表面科学。生物表面是指与生命单元有关的表面或界面，主要为生物大分子(蛋白质、核酸、糖类等)表面、生物膜表面、细胞表面以及与生命单元发生作用的物质界面等。这些元素或单元都具有很大的比表面。物质、能量、信息的传输和传递等重要的生命过程都发生在生命物质的表面或界面。因此DNA、RNA、蛋白质、细胞膜、细胞等生命单元的表面行为一直是表面科学广泛关注的领域之一。只是早期研究因实验条件的限制而发展缓慢。但在微电子学和计算机科学的快速发展和推动下，H.G.Hansma在2001年提出的生物表面科学已成为一门新兴交叉学科［4］。因生物表面在许多化学过程中起着重要的作用，所以在生物表面科学中，研究生物大分子(生命单元)的表面几何复杂性(即粗糙度)就显得十分重要。因小分子与大分子间或大分子与大分子间的相互作用均发生在分子表面［4-5］，所以化学染料分子与生物大分子的结合与二者分子空间构象密切相关［6-7］。如当机体感染肝炎病毒后，病毒除了侵犯肝细胞外，还可引起淋巴细胞核结构受损［8］，即淋巴细胞中核酸、蛋白质等大分子物质表面几何复杂性发生变化，这些大分子物质与染料分子的结合则会异于正常细胞，从而使淋巴细胞核化学染色表面粗糙度即表面纹理发生改变。

在解决了血细胞载体(载玻片)光密度一致性问题的基础上，将小波变换(wavelet transformation)、经验模式分解(empirical mode decomposition EMD)与图像多个波长光密度(optical density)测定特征等结合起来，提取淋巴细胞核表面结构微小变化的特征信息，以期用于检测分析肝脏疾病时外周血淋巴细胞的受损情况及诊断应用。

1 材料与方法

1.1 血细胞化学染色载体的选择

将血液涂制在载体(一般为普通玻璃片，称载玻片)上成为血膜，也称血涂片，然后进行细胞化学染色。这是现行一般的血细胞化学染色检查方法，在整个制片和染色检查过程中是从不考虑载体(载玻片)表面的光学和化学性质的，玻片随机取用，甚至新旧玻片混杂反复使用。但从生物表面化学知识可知，实际上血液中的蛋白质在载体表面的吸附会影响白细胞、血小板等的黏附从而会影响其形态［9］。因此为了尽量减少白细胞在载体上黏附时发生形态的细微变化，所以在作血涂片细胞分析时应考虑载体表面性质的一致性。除此之外，还有另外一个更重要的一致性，那就是当作细胞光密度测定时，要充分考虑血液涂片载体光学性质的一致性。推导如下:

设M为被测物质质量;S为像素点面积;r0为图像背景灰度;r为像素点变化量;由Lambert-Beer定律知:

1.2 标本

取分光光度计比色杯透明面作血细胞涂片载体，按白细胞分类计数方法采集血液标本，推制成血膜后，在相同染色条件(试剂、温度)和一致的显微镜光程下，用OLYMPUS CX31摄影显微镜随机摄取分散存在的淋巴细胞，获取淋巴细胞图像后存贮在计算机硬盘中。

肝硬化淋巴细胞标本取自经临床确诊为病毒性肝炎肝硬化病人外周血。肝癌淋巴细胞标本取自经临床确诊为原发性肝癌病人外周血。

1.3 淋巴细胞化学染色

染色方法采用甲基绿-派罗林染色法。其染色基本原理为甲基绿和派罗林能与聚合程度不同的DNA、RNA及蛋白质等结合。因染料与生物大分子的结合强度不同而表现出不同的染色效果。

(1)取外周血液涂片，干燥后放入偏酸混合固定液中固定10 min，取出。

(2)滴加配好的甲基绿-派罗林染液于血膜上，染色15 min。

(3)蒸馏水冲洗。

(4)乙醇溶液分色、晾干，显微镜检查并摄取淋巴细胞图像。

1.4 小波变换和经验模式分解

小波(Wavelet)分析被誉为数学“显微镜”。目前已经在较多学科领域内得到了应用，取得了一定的科研成果。小波变换是信号处理的前沿课题，也是多学科关注的热点［10］，小波分析及其在图像处理中的应用请参阅文献［11］等。而上世纪末才提出的经验模式分解(Empirical Mode Decomposition EMD)是当前提取和分析数据序列趋势的最好方法之一，具体参见文献［12-13］。从淋巴细胞图像的细胞核表面分割出40像素×40像素的核表面图像作小波变换。提取小波水平、垂直、对角系数矩阵，此矩阵中包含了细胞核复杂的化学成分信息。取系数矩阵中N个数据求平均，得到长为3n的序列作经验模式分解(EMD)。由EMD分解为有限个具有不同特征尺度的数据序列，每一个序列为一个固有模式函数(intrinsic mode function，IMF)。经EMD分解出来的前几个IMF分量往往集中了原始信号最显著和最重要的信息，从这个角度，EMD方法可以看做是一种新的主成分分析方法。

1.5 图像光密度、能量测定和特征数据组合

为深入考察细胞内生物大分子(生命单元)的表面几何复杂性及其理化性质的变化与细胞染色后核表面纹理和颜色结构变化之间的关系，进一步测定了淋巴细胞核图像的红光光密度(density〈red〉)、绿光光密度(density〈green〉)和蓝光光密度(density〈blue〉)、平均光密度(density〈mean〉)、最大光密度(density〈max〉)和累积光密度(IOD Integrated Optical Density累积光密度是测量被测图像面积内各像素点光密度之和)。总的来说，各光密度值可代表或反映细胞核着色的深浅及颜色结构，可用于了解核内物质的构成与相对含量。同时还测定了图像的能量(energy E)，能量用于分析了解图像灰度分布均匀程度和图像表面纹理粗细度，图像表面纹理越细，能量就越小，纹理越粗，能量就越大。这样把每一个淋巴细胞核样本图像从1.4中所得矩阵(由前4个IMF组成)用奇异值分解方法得到“小波纹理特征值”，再加上这些光学特征数据，就构成了一个“图像组合特征”多维向量，用支持向量机(SVM)进行模式识别。另外，还测定了淋巴细胞核图像的对比度(contrast C)、均匀性(homogeneity H)、相关性(correlation R)等，但在后面的分类识别测试试验中，发现它们对提高淋巴细胞核表面图像的分类识别率影响不是很大，因此最后舍去了。

2 结果

从摄影显微镜随机摄取的淋巴细胞图像的胞核表面分割出大小为40像素×40像素的图像，进行小波和经验模式分解。其分割出的待分析图像结果如图1所示。

经验模式分解(EMD)前4个IMF结果见图2。

淋巴细胞核表面“图像组合特征”用支持向量机(SVM)分类识别结果见表1。

表1是600多幅外周血淋巴细胞化学染色核表面“组合特征多维向量”的分类识别结果，可见图像组合特征多维向量作为识别淋巴细胞核染色表面变化新的特征量，可以有效地反映不同淋巴细胞核表面的差异。可以看出，将淋巴细胞核图像的表面纹理特征、能量与表达反应强度或物质含量的测量参数光密度值等结合起来构成组合特征，可以同时客观地获得染色淋巴细胞核表面的更多特征信息和核内一些物质(如 DNA，RNA等)的量及结构信息，克服了淋巴细胞核染色表面微小变化人眼不能定量区分识别的困难，较好地分类识别了正常与肝癌、肝硬化患者以及肝癌与肝硬化患者的外周血淋巴细胞。

图1 淋巴细胞染色图像。(a)正常淋巴细胞;(b)肝癌淋巴细胞;(c)肝硬化淋巴细胞;(d)肝癌淋巴细胞Fig.1 Lymphocyte＇s staining image.(a)normal lymphocyte;(b)liver cancer lymphocyte;(c)hepatocirrhosis lymphocyte;(d)liver cancer lymphocyte

图2 小波变换经EMD分解后的前4个IMF分量。(a)第一分量;(b)第二分量;(c)第三分量;(d)第四分量Fig.2 The first four IMFs of wavelet after EMD.(a)the first component;(b)the second component;(c)the third component;(d)the fourth component

表1 细胞核表面组合特征识别结果Tab.1 The results of independent test by combining image feature and optical parameters

当然经过染料着色的淋巴细胞核表面已不是原始的细胞核生物表面，特别是细胞经偏酸固定液作用后，细胞中大分子物质 DNA、RNA、蛋白质等的高级结构、聚合程度等以及表面化学、表面物理性质都发生了变化，因此可以说本实验是外周血中淋巴细胞核经化学染色后的表面分析。

3 讨论

由Singh等首次提出的单核细胞凝胶碱性电泳技术(single cell gel electrophoresis assay，SCGE)，又称为慧星试验(comet assay)，是一种检测真核细胞DNA受损断裂的方法［14］。何玮等将其用于慢性乙型肝炎合并肝癌患者淋巴细胞DNA受损的分析，发现慢性乙肝患者外周血中淋巴细胞有少量慧星尾，肝癌患者有明显的慧星尾存在，其原因可能是HBV DNA整合到外周血淋巴细胞内，引起淋巴细胞的DNA 高级结构发生了改变［8，15］。Wang 等［16］和张仁云等［7］用电化学方法和光谱法研究了亚甲基绿和亚甲基蓝两种染料与DNA的相互作用。特别是张仁云等通过光谱法研究，亚甲基绿(MG)与DNA结合越多，MG的吸收峰下降强度越多，同时吸收峰由647 nm红移到656 nm，红移约9 nm，原因是亚甲基绿分子插入到DNA碱基对之间的几率增大，亚甲基绿发色基团π—π*电子与DNA碱基的电子态相互交叠成键，由此导致吸收峰红移。因此认为亚甲基绿是以插入方式与DNA结合，而亚甲基蓝(MB)则可能同时存在插入和沟槽两种结合方式且以沟槽方式为主。但可得出重要的结论是:分子结构的微小变化，导致分子表面性质改变，都会影响到分子之间的联系与结合。本实验中，血液制成血膜后，在偏酸性固定液作用下，核内 DNA、RNA及蛋白质等大分子结构、表面性质均发生了变化。根据核酸的理化性质，在酸性条件下，嘌呤碱糖苷健易断裂，核酸受损，正常DNA超螺旋结构变得松驰，分子大小和分子构象发生改变;核酸解离而带电。因此染料与DNA的结合，无论是插入方式或沟槽方式，与用乙醇或10%甲醛生理盐水作固定液的细胞相比，核表面会出现更多的色彩与纹理。在统一的化学染色条件下，肝癌、肝硬化疾病时受损淋巴细胞核中生物大分子物质性质已发生改变，因而与染料结合后所产生的核表面色彩及纹理与正常淋巴细胞比较则出现一定的差异，经“图像组合特征”提取分析，从而反映出细胞核内蛋白质、核酸等生物大分子的变化情况(从生物大分子联系到细胞核表面，从微观联系到宏观表象)。

4 结论

针对化学染色后淋巴细胞核表面纹理结构和颜色结构微小变化的特征提取和识别，本研究提出一种 Wavelet-EMD-OP(optical parameters)综合模型。根据计算机对血细胞图像分析的要求，利用分光光度计比色杯透明面作血细胞涂片，改进了血细胞涂片载体，从而满足了细胞化学染色定量分析的要求。采用图像组合特征方法，即将图像纹理特征、灰度和各波长光密度等有效地综合利用起来，构造了具有明确的数学、物理和化学意义的一种组合特征向量来分析和描述淋巴细胞核表面信息。通过以上工作，说明利用计算机数值技术，同样可对受损淋巴细胞进行分析。解决了淋巴细胞核染色表面的微小变化人眼不能定量识别的困难，完成了正常淋巴细胞、肝癌病人淋巴细胞和肝硬化病人淋巴细胞化学染色后核表面的分类识别。从生物表面分析角度，描述了肝脏疾病时淋巴细胞核染色后纹理、色彩变化的原因。同时也证实了系统生物学的观点:人体是一个复杂系统，存在于这一系统中的物质以及细胞、组织器官之间必然存在着相互联系和相互作用(相互影响)，通过计算生物学方法来定量描述和预测生物功能、表型和行为等等是有效可行的。进一步结合临床分析是要继续进行的工作。

(致谢:感谢贵阳第五医院(贵阳传染病院)检验科王义光、熊金风二位主任和贵州省肿瘤医院检验科主任王伟对本工作的大力支持和帮助;感谢林慧敏，孙瑜二位老师的通力协助)

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Surface Analysis of Lymphocyte Nucleus by Chemical Staining

LI Da-Dong1*YANG Xing-Lin2
1(Zhejiang Ocean Universty Medical College，Zhoushan 316004，China)2(The Fifth Pepole’s Hospital of Guiyang，Guizhou 550001，China)

R318

A

0258-8021(2010)02-0190-05

10.3969/j.issn.0258-8021.2010.02.006

2009-02-15，

2009-10-20

浙江省教育厅科研项目(20070930)

*通讯作者。 E-mail:lddcg1222@yahoo.com.cn