乳腺癌组织中FOXO1蛋白表达与细胞增殖和细胞凋亡的相关性

颜亚晖 钱燕春

(中南大学基础医学院病理学系 湖南长沙410078;1湖南永州职业技术学院 永州425006)

乳腺癌组织中FOXO1蛋白表达与细胞增殖和细胞凋亡的相关性

颜亚晖 钱燕春1＊

(中南大学基础医学院病理学系 湖南长沙410078;1湖南永州职业技术学院 永州425006)

目的 研究乳腺癌组织中FOXO1蛋白表达与细胞增殖和细胞凋亡的相关性。方法 利用免疫组织化学技术检测60例乳腺浸润性导管癌、21例导管内癌、30例导管内乳头状瘤及15例正常乳腺组织中 FOXO1、Ki-67及活化Caspase-3蛋白的表达。结果 FOXO1及活化Caspase-3蛋白在乳腺浸润性导管癌和导管内癌中的阳性表达率和阳性表达强度均显著低于导管内乳头状瘤和正常乳腺组织。Ki-67蛋白在乳腺浸润性导管癌和导管内癌中的阳性表达率和阳性表达强度均显著高于导管内乳头状瘤和正常乳腺组织;浸润性导管癌中FOXO1、Ki-67及活化Caspase-3的表达强度与癌组织的病理学分级无关;在浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中,FOXO1蛋白的表达强度与 Ki-67呈显著负相关,而与活化Caspase-3的表达强度呈显著正相关。结论 FOXO1蛋白的表达下调可能与乳腺导管癌的发生密切相关;该蛋白可能是一种细胞增殖的负性调节因子,同时亦是一种细胞凋亡促进因子,FOXO1基因有可能成为乳腺浸润性导管癌基因治疗的有效靶点。

乳腺癌;FOXO1;细胞增殖;细胞凋亡

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发生发展与细胞增殖和细胞凋亡机制异常密切相关。FOXO1(Forkhead transcription factors)蛋白作为FOXO转录因子亚家族中的一员,在细胞增殖、细胞凋亡和代谢等多种生理效应中扮演了重要的角色,也是胰岛素信号通路中的关键分子[1-3]。本研究利用免疫组织化学检测乳腺导管内乳头状瘤、导管内癌及浸润性导管癌组织中FOXO1、Ki-67及活化Caspase-3蛋白的表达,并探讨其相关性。

材料和方法

1.标本 所有标本均为2009年2月-2010年2月湘雅医院乳腺外科手术切除的标本。浸润性导管癌60例,平均年龄41.8(37-61)岁,按WHO标准分级,其中I级18例,Ⅱ级32例,Ⅲ级10例;导管内癌21例,平均年龄38.4(31-41)岁,导管内乳头状瘤30例,平均年龄31.3(28--43)岁,其中有非典型增生者12例;乳腺根治手术切除的正常乳腺组织15例作正常对照。所有标本均经10%Formalin固定,常规石蜡包埋,连续切片,病理学确诊。

2.试剂 抗FOXO1蛋白多克隆抗体系美国Abgent公司产品;Ki-67、活化Caspase-3抗体及EliVisionTM二步法免疫组化染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。

3.免疫组化染色 石蜡切片脱蜡水化;用3% H202封闭内源性过氧化物酶;PBS洗后,EDTA溶液微波修复 6 min,滴加一抗 37℃孵育 1 h;PBS洗后,滴加过氧化物酶标记的二抗,37℃孵育45 min;PBS洗后,DAB显色;苏木精复染、脱水、透明、中性树胶封片。以 PBS替代一抗或二抗作阴性对照。

4.结果判断 采用Bresalier[4]半定量公式判断染色结果。每张切片中随机选取10个视野,根据细胞染色强度分为4级,并分别计分:(0)阴性,细胞无着色;(1)弱阳性,细胞着浅黄色;(2)中度阳性,细胞着棕黄色;(3)强阳性,细胞着棕褐色。计数每一强度的视野数,根据下列公式计算每张切片的平均染色强度:IS(intensity score) =∑{(0×F0) +(1×F1) +(2×F2) +(3×F3)},F=%×10视野。

5.统计学处理 采用SPSS15.0统计软件进行t检验、F检验及卡方检验。

结 果

1.FOXO1、Ki-67及活化Caspase-3阳性信号定位 FOXO1和 Ki-67阳性信号位于细胞核,活化Caspase-3阳性信号主要位于细胞浆,少许为核阳性(图1-3)。

图1浸润性导管癌中FOXO1蛋白的表达。二步法,×400 图2浸润性导管癌中Ki-67蛋白的表达。二步法。×400图3浸润性导管癌中活化caspase-3蛋白的表达。二步法,×400Fig.1 Expression of FOXO1 protein ininfiltrating duct carcinomas,Elivision,×400.Fig.2 Expression of Ki-67 protein in infiltrating duct carcinomas,Elivision,×400.Fig.3 Expression of activated-caspase-3 protein in infiltrating duct carcinomas,Elivision,×400

2.FOXO1蛋白在浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中的阳性表达率及阳性表达强度 FOXO1在浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中的阳性表达率分别为 20%(12/60)、38.1%(8/21)、80%(24/30)及100%(15/15),其阳性表达强度分别为0.64±0.28、0.75±0.31、2.12±0.47和2.51 ±0.41,统计学分析显示FOXO1蛋白在浸润性导管癌和导管内癌中的阳性表达率和表达强度显著低于导管内乳头状瘤和正常乳腺组织(P<0.01);在浸润性导管癌和导管内癌中FOXO1蛋白的阳性表达率和表达强度未见明显差异(P>0.05);导管内乳头状瘤中FOXO1蛋白的阳性表达率和表达强度与正常乳腺组织亦未见明显差异(P>0.05)(表1)。FOXO1蛋白在具有非典型增生的导管内乳头状瘤的阳性表达强度明显低于无非典型增生者(P<0.05)。

3.Ki-67蛋白在浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中的阳性表达率及阳性表达强度 Ki-67蛋白在浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中的阳性表达率分别为95%(57/60)、85.7%(18/21)、40%(12/30)和 20%(3/15);阳性表达强度分别为2.21±0.49、1.94±0.81、0.51±0.42和0.33± 0.17。统计学分析显示 Ki-67蛋白在浸润性导管癌和导管内癌中的阳性表达率和表达强度显著高于导管内乳头状瘤和正常乳腺组织(P<0.01);Ki-67在浸润性导管癌和导管内癌中蛋白的阳性表达率和表达强度未见明显差异(P>0.05);导管内乳头状瘤内 Ki-67蛋白的阳性表达率和表达强度与正常乳腺组织亦未见明显差异(P>0.05)(表1);Ki-67蛋白在具有非典型增生的导管内乳头状瘤的阳性表达强度明显高于无非典型增生者(P<0.05)。

4.活化 caspase-3在浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中的阳性表达率及阳性表达强度 活化caspase-3在浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中的阳性表达率分别为35%(21/60)、47.6%(10/ 21)、83.3%(25/30)及93.3%(14/15),其阳性表达强度分别为 0.72±0.38、0.95±0.43、2.31±0.57和2.41±0.33。统计学分析显示活化caspase-3在浸润性导管癌和导管内癌中的阳性表达率和表达强度显著低于导管内乳头状瘤和正常乳腺组织(P<0.01);活化caspase-3在浸润性导管癌和导管内癌中的阳性表达率和表达强度未见明显差异(P>0.05);导管内乳头状瘤中活化caspase-3的阳性表达率和表达强度与正常乳腺组织亦未见明显差异(P>0.05)(表1);活化caspase-3在具有和不具有非典型增生的导管内乳头状瘤的阳性表达强度未见明显差别(P>0.05)。

5.浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中 FOXO1蛋白的表达强度与Ki-67蛋白与活化Caspase-3表达强度的相关性在浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中FOXO1蛋白的表达强度与 Ki-67蛋白的表达强度呈显著负相关(P<0.01),而与活化caspase-3表达强度呈显著正相关(P<0.01)(表2, 3)。

6.FOXO1、Ki-67及活化caspase-3蛋白表达强度与浸润性导管癌病理学分级的关系 在浸润性导管癌中FOXO1、Ki-67及活化caspase-3的表达强度与癌组织病理学分级无关(P>0.05)(表4)。

表1 FOXO1、Ki-67及活化caspase-3蛋白在浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中的表达强度Table 1 THE expression intensity of FOXO1,Ki-67 and activated caspase-3 proteins in breast infiltrating duct carcinomas,intraductal carcinomas,intraductal papillomas and normal breast tissues

讨 论

FOXO家族是PI3k/Akt信号转导通路的下游靶点,由功能相关的 FOXO1、FOXO3a和FOXO4三个成员组成,该家族蛋白是保守的基因转录激活因子,参与细胞周期的抑制、细胞凋亡调控、抗氧化应激、DNA修复等[5-7]。在子宫内膜癌中 FOXO1蛋白表达显著降低[7-9];Guttilla等[10]研究显示乳腺癌组织中FOXO1 mRNA表达下调,体外实验研究发现,在FOXO1低表达的乳腺癌细胞系MCF-7中,利用反义寡核苷酸抑制miR-27a, miR-96 and miR-182可显著提升FOXO1蛋白的表达,从而降低细胞增殖、抑制细胞周期进程,并诱导细胞死亡。在子宫内膜癌细胞系 HEC-1B和Ishikawa中亦获得相似的结果[8]。认为 FOXO1蛋白可能是一种候选的抑癌基因,参与肿瘤的发生。

表2 浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中FOXO1蛋白的表达强度与Ki-67蛋白表达强度的相关性Table 2 The relationship of expression intensities of FOXO1 and Ki-67proteins in breast infiltrating duct carcinomas,intraductal carcinomas,intraductal papillomas and normal breast tissues

表3 浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中FOXO1蛋白的表达强度与caspase-3蛋白表达强度的相关性Table 3 Relationship of expression intensities of FOXO1 and activated Caspase-3 proteins in breast infiltrating duct carcinomas,intraductal carcinomas,intraductal papillomas and normal breast tissues

表4 FOXO1、Ki-67及活化caspase-3蛋白表达强度与浸润性导管癌病理学分级的关系Table 4 The relationship of expression intensity of FOXO1,Ki-67 and activated caspase-3 proteins with pathological grades of infiltrating duct carcinomas

本文结果显示浸润性导管癌中FOXO1蛋白的阳性表达率和阳性强度均显著低于导管内乳头状瘤和正常乳腺组织,而与导管内癌比较未见明显差异;FOXO1蛋白的阳性表达强度与浸润性导管癌的病理学分级无关,表明FOXO1的表达下调可能与乳腺导管癌的发生密切相关。

Ki-67和活化Caspase-3蛋白是分别与细胞增殖和细胞凋亡相关的标记物,其表达水平的高低能反映细胞增殖和细胞凋亡的水平。本研究结果显示浸润性导管癌中Ki-67蛋白的阳性率和阳性表达强度显著高于导管内乳头状瘤和正常乳腺组织,而Caspase-3蛋白的阳性率和阳性表达强度显著低于导管内乳头状瘤和正常乳腺组织;但两者的阳性率和阳性强度与导管内癌比较均未见明显差异,且在浸润性导管癌中 Ki-67及活化Caspase-3的表达强度与癌组织的分化程度无关,进一步表明在乳腺浸润性导管癌的发生过程中细胞增殖和细胞凋亡的异常起着十分重要的作用。

相关性分析显示,浸润性导管癌、导管内癌、导管内乳头状瘤及正常乳腺组织中FOXO1蛋白的表达强度与 Ki-67蛋白表达强度呈显著负相关,而与活化Caspase-3蛋白表达强度呈显著正相关,提示FOXO1蛋白是一种细胞增殖的负性调节因子,同时亦是一种细胞凋亡促进因子,故该基因有可能成为乳腺浸润性导管癌基因治疗的有效靶点。

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RELATIONSHIP BETWEEN EXPRESSION OF FOXO1 PROTEIN AND CELLPROLIFERATION AND APOPTOSIS IN BREAST CANCER

Yan Yahui Qian Yanchun1＊
(Department ofPathology,B asic Medical College,Central South University,Hunan Changsha4100781Yongzhou Occupational and Technological College,Yongzhou425006,China)

Objective To investigate the relationship between the expression of FOXO1 protein and the cell proliferation and apoptosis in breast cancer.Methods Immunohistochemistry was used to detect expressions of FOXO1,Ki-67 and activated caspase-3 proteins in 60 breast infiltrating duct carcinomas,21 intraductal carcinomas,30 intraductal papillomas and 15 normal breast tissues.Results The positive rates and expression intensity of FOXO1 and activated caspase-3 proteins in breast infiltrating duct carcinomas and intraductal carcinomas were significantly lower than those in intraductal papillomas and normal breast tissues.The positive rates and expression intensity of Ki-67 protein in breast infiltrating duct carcinomas and intraductal carcinomas were significantly higher than those in intraductal papillomas and normal breast tissues.The expression strength of FOXO1,Ki-67 and activated caspase-3 proteins were no related to the pathological grade of cancer tissues in breast infiltrating duct carcinomas.The expression intensity of FOXO1 protein was significantly negatively correlated with that of Ki-67 protein,and positively correlated with that of activated caspase-3 protein in all the cases.Conclusion The down regulation of FOXO1 protein expression may be related to breast carcinogenensis.The FOXO1 protein may be a down-regulator of cell proliferation and promoter of apoptosis.FOXO1 gene may become an effective target for the gene therapy of breast cancer.

Breast cancer;FOXO1;Cell proliferation;Apoptosis

R329

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.015

2010-01-05

2010-03-01

颜亚晖,女(1971年),汉族,实验师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)