帕金森病模型大鼠行为学改变与黒质致密部多巴胺能神经元存活率之间的相关性

刘丽敏，李博，孙作厘，贾军，汪璇，王晓民

(首都医科大学基础医学院生理学系，教育部神经变性病重点实验室，北京 100069)

研究报告

帕金森病模型大鼠行为学改变与黒质致密部多巴胺能神经元存活率之间的相关性

刘丽敏，李博，孙作厘，贾军，汪璇，王晓民

(首都医科大学基础医学院生理学系，教育部神经变性病重点实验室，北京 100069)

目的探讨线刀损毁内侧前脑束建立的帕金森病模型大鼠行为学改变与黒质致密部多巴胺能神经元存活率之间的相关性。方法采用可伸缩线刀切断大鼠内侧前脑束建立单侧损伤的帕金森病大鼠模型;皮下注射阿朴吗啡后测试大鼠的旋转行为;取中脑黑质切片进行酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色，通过计数黑质致密部酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目得到多巴胺能神经元存活率。结果模型组大鼠损伤侧酪氨酸羟化酶阳性神经元的数目明显下降，而由阿朴吗啡诱导的旋转行为明显增加。结论线刀损毁术后4周，帕金森病模型大鼠由阿朴吗啡诱导的旋转行为和黒质致密部多巴胺能神经元存活率之间存在着明显的负相关。

帕金森病;内侧前脑束;阿朴吗啡;多巴胺能神经元

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是继阿尔茨海默病后第二大常见的中枢神经系统退行性疾病，其主要病理改变为黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元的渐进性死亡，导致纹状体内DA含量降低，当DA含量减少到正常值的10%～30%时，即出现以静止性震颤、运动迟缓、肌肉僵直为特征的临床症状［1］。过去的二十年中，尽管临床实验以及在体和离体动物实验使PD的病因学和病理学的研究取得了很大进展，但是PD发生的分子和细胞学机制仍然不是很清楚，因此研究者们仍然需要依赖动物模型对其病因学和病理学进行研究。在本实验中我们采用机械切断单侧内侧前脑束(medial forebrain bundle，MFB)的方法建立PD大鼠模型，研究PD模型大鼠由阿朴吗啡(apomorphine，APO)诱导的旋转行为和黒质致密部DA能神经元存活率之间的关系，以期为判断PD的病情进展及各种治疗方法的疗效等研究提供客观依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:健康Wistar雄性大鼠(SPF级)，体质量220～240 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供【SCXK(军)2007－004】，无菌手术在首都医科大学实验动物科学部屏障动物实验设施进行【SYXK(京)2005－0022】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 主要试剂:水合氯醛(北京化学试剂公司);阿朴吗啡，小鼠单克隆抗TH抗体(Sigma公司); ABC－4002免疫组化试剂盒，ZLI9032 DAB显色试剂(北京中杉金桥技术有限公司)。其他常规试剂主要为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器:大鼠脑立体定位仪，可伸缩线刀(美国KOPF公司);大鼠旋转行为记录仪(美国Columbus Instruments);冰冻切片机(德国Leica公司);普通光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 实验方法

健康成年雄性W istar大鼠50只，随机分为Sham(假手术对照)组和PD模型组。两组大鼠于术后第4周末检测由APO诱发的旋转行为，行为学检测结束后2 d，经左心室灌流固定，取脑组织冰冻切片，进行酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)免疫组化染色，计数黒质致密部TH阳性神经元的数量。模型组选取向未损伤侧净旋转圈数大于40 r/ 30 min的大鼠，将其旋转圈数与黒质致密部TH阳性神经元存活率之间做相关性分析。

1.2.1 大鼠脑立体定位手术:大鼠腹腔内注射6%的水合氯醛将其麻醉(350 mg/kg，i.p.)，俯卧位固定于脑立体定位仪上。消毒皮肤，暴露颅骨，调整门齿杆，使前、后囟位于同一水平面。在前囟后3.8 mm、矢状线右侧旁2.4 mm处，用牙科钻钻透颅骨，然后缓慢地将Scoutern线刀套管进到硬膜下8.0 mm，旋动旋钮，将线刀从针管中伸出2.0 mm，然后将线刀上移3.0 mm，再回到原处，重复2次，缓慢收刀，退出套管，缝合皮肤。

1.2.2 旋转行为测试方法:先给大鼠穿上束缚套后置于旋转行为测试仪中适应约5 m in，待大鼠安静后皮下注射APO(0.5 mg/kg)，给药5 m in后由旋转行为测试仪开始统一记录，设定测转时间为30 m in。旋转行为的表示方法:以向左侧(非损伤侧)旋转与向右侧(损伤侧)旋转总转数的差值为净旋转次数。测试时注意保持测试环境安静与黑暗。

1.2.3 免疫组织化学染色:于大鼠腹腔内注射10%的水合氯醛将其深麻醉，剖开胸腔暴露心脏，经左主动脉灌流150 m L 37℃的生理盐水，随后灌流200 m L冰冷的4%多聚甲醛。打开颅骨取出全脑，置于4%多聚甲醛中后固定6 h，随后用20%和30%的蔗糖溶液梯度沉淀脑组织。自蔗糖溶液中取出脑组织，OCT包埋，用冰冻切片机进行中脑切片，厚度为35 μm。每隔6张切片取一张，共留取切片6组，每组至少留有6～8张切片。切片浸入磷酸缓冲液(PBS，以下均为0.01 mol/L，pH 7.4)，5 m in×3次→0.3%Triton X－100，室温30 m in→PBS，5 m in×3次→0.3%H2O2，室温30 m in→PBS，5 m in×3次→10%正常马血清，室温15 m in→吸去马血清，滴加小鼠抗大鼠TH单克隆一抗(1∶10 000)，4℃，24 h→PBS，5 m in×3次→滴加马抗小鼠二抗(1∶200)，室温2 h→PBS，5 m in×3次→HRP标记的链霉卵白素，37℃，30 m in→PBS，5 min×3次→DAB显色液显色约5 m in→PBS→梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每只大鼠至少取6张切片进行黑质致密区(substantia nigra pars compacta，SNpc)TH阳性细胞计数，并计算每只大鼠右侧和左侧阳性细胞数的比值。

1.2.4 统计学方法:采用GraphPad Prism 4.0软件进行统计分析及作图，数据以(±s)表示，两组数据间差异用成组设计的两样本均数的t检验。以P＜0.05作为统计学差异的界限。

2 结果

2.1 PD模型大鼠黑质致密部TH阳性神经元免疫组化结果

TH免疫组化染色结果显示(图1，彩插5)，术后4周Sham组大鼠损伤侧(右侧)和未损伤侧(左侧)黑质致密部TH阳性神经元的存活率没有明显差别，而模型组大鼠损伤侧黑质致密部TH阳性神经元数量明显减少，分布稀疏，残存神经元数量为未损伤侧的(60.55±8.16)%(P＜0.01)。

2.2 阿朴吗啡诱发的大鼠旋转行为与黑质致密部TH阳性神经元存活率之间的相关性

术后4周APO可诱发Sham组大鼠出现向两侧的轻度旋转行为，但左右侧旋转次数几乎相同，在本实验中其平均净旋转次数为(4.25±6.63)r/30 m in。在模型组大鼠中，向未损伤侧净旋转圈数大于40 r/30 min的为15只，占模型组大鼠总数的60%。统计学结果显示大鼠由APO诱发的旋转行为与黑质致密部TH阳性神经元存活率之间呈明显的负相关(R2=0.53，P＜0.01)。如图2。

图2 阿朴吗啡诱发的大鼠旋转行为与黑质致密部TH阳性神经元存活率之间的相关性Fig.2 Correlation of apomorphine－induced rotations and dopam inergic neuron survival rate in the SNpc of parkinsonian rat model.Statistical analysis revealed a significant inverse correlation between the number of rotations over 30 min after the apomorphine injection and the decreased TH－positive neurons survival rate 4 weeks after MFB axotomy.R2，coefficient of determination.

3 讨论

在疾病的研究过程中，一个好的动物模型不仅能帮助我们进一步解释疾病病因学的根本机制，而且有助于新的神经保护药物和治疗策略的研究发展，为基础研究和应用研究提供必不可少的工具。现在PD研究中常用的动物模型主要包括化学损伤模型、机械损毁模型和转基因动物模型，其中化学损伤模型应用最为广泛，所用的神经毒素主要包括6－OHDA、MPTP和鱼藤酮等［2］。6－OHDA是第一个被用来选择性诱导DA能神经元死亡的神经毒素，它可通过介导细胞氧化应激等反应导致黑质DA能神经元死亡，最终引发黑质－纹状体通路功能减退并产生类PD症状［3］，但其毁损模型产生的效应一般为急性的，有研究报道6－OHDA注入黑质和MFB后24h之内DA神经元开始死亡，95%的神经元于3d内死亡［4］，明显不同于人类PD缓慢进展的病理特点，因此该模型常被用来模拟晚期PD的病理改变，多用于细胞移植和基因治疗等实验研究。MPTP是目前最为常用的制备PD动物模型的神经毒素，MPTP灵长类模型在病理、生化及症状方面均与人类PD表现相似［5，6］，是目前最合适的动物模型之一，但由于经济、伦理道德等原因，灵长类模型还只在世界上少数几个实验室应用。目前最为普遍应用的MPTP模型为小鼠模型，但其各方面均不及灵长类模型经典，病变过程通常是急性且可逆的，无法完全模拟PD的发病特点。近年来也建立了很多转基因动物模型，但这些模型制备过程复杂、技术要求高和费用昂贵。

本实验中我们采用的PD模型为可伸缩线刀切断单侧MFB建立的机械损毁大鼠模型。MFB为黑质DA能神经元发出的传出纤维投射到纹状体的通路，此通路是纹状体DA的主要来源，纹状体合成的神经营养因子也是通过这条通路以逆轴浆转运的方式到达SNpc，维持DA能神经元的存活。因此损伤MFB后不仅可造成轴突末梢的变性还可造成DA能神经元因缺乏逆向的营养支持而死亡。Knusel［7］和Lapchak［8］曾报道在MFB损伤后第18和19天损伤侧DA能神经元的死亡率分别为44%和50%，而且这种单侧MFB切断并不影响对侧TH阳性神经元的数量。Brecknell等［9］则通过逆向追踪发现MFB损伤侧的黑质神经元在损伤后1周时有28%的神经元死亡，随后呈进行性丢失，在第10周时黒质神经元死亡率达到最大，在此时只有29%的神经元存活。这些结果表明该模型DA能神经元的死亡是渐进性的，能较好地模拟PD病程长、进行性发展的病变特点，但这些研究并未阐明DA神经元死亡数量和模型大鼠异常行为之间的关系。

行为学作为一种直观可靠的指标，在PD的发病机制研究、病程监测及疗效评价中发挥着重要作用。临床资料显示PD患者的主要行为学改变为静止性震颤、肌肉僵直和运动迟缓等。单侧切断MFB所建立的PD模型大鼠同样可出现行为学的改变，如平衡协调能力下降及可出现由药物诱发的旋转行为等。在本实验中，注射APO能诱发Sham组大鼠向两侧的轻度旋转行为，左右侧旋转次数几乎相同，而模型组大鼠向未损伤侧的旋转行为明显增加。一般认为，模型组大鼠旋转行为增加的机制是黑质DA能神经元损伤、变性到一定程度，由于DA递质释放量的急剧降低，引起纹状体突触后膜DA受体超敏。注射APO后可以强烈地激活损伤侧纹状体内的DA受体，使动物向健侧旋转。本实验结果首次表明，线刀损毁MFB建立的帕金森病模型大鼠的异常旋转行为与黑质致密部TH阳性神经元存活率之间呈明显的负相关。TH是DA合成的限速酶，存在于DA能神经元的胞质内，通过TH免疫组化染色法可判断DA能神经元的数目。因此在以后的实验中，我们可以通过线刀损毁MFB建立的PD模型大鼠的异常旋转行为判断黑质致密部DA能神经元存活率，如根据图2所示，当模型大鼠旋转圈数为130 r/30 min时，黑质致密部DA能神经元存活率约为50%，从而为监测PD的病情进展及各种治疗方法的疗效提供直观的指标。

(本文图1见彩插5。)

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［3］王涛，左萍萍.帕金森病实验动物模型研究进展.中国神经免疫学和神经病学杂志［J］.2008，15(6):455－457.

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［7］Knusel B，Beck KD，W inslow JW，et al.Brain－derived neurotrophic factor administration protects basal forebrain cholinergic but not nigral dopaminergic neurons from degenerative changes after axotomy in the adult rat brain［J］.J Neurosci，1992，12(11):4391－4402.

［8］Lapchak PA，Beck KD，Araujo DM，et al.Chronic intranigral administration of brain－derived neurotrophic factor produces striatal dopaminergic hypofunction in unlesioned adult rats and fails to attenuate the decline of striatal dopaminergic function following medial forebrain bundle transection［J］.Neuroscience，1993，53(3):639－650.

［9］Brecknell JE，Dunnett SB，Fawcett JW.A quantitative study of cell death in the substantia nigra following a mechanical lesion of the medial forebrain bundle［J］.Neuroscience，1995，64(1): 219－227.

Correlation of Behavioral Changes and Survival Rate of Dopam inergic Neurons in the Substantia Nigra Pars Com pacta in Parkinsonian Rat M odel

LIU Li－min，LI Bo，SUN Zuo－li，JIA Jun，WANG Xuan，WANG Xiao－min
(Department of Physiology，School of Basic Medical Sciences，Capital Medical University，Key Laboratory of Neurodegenerative Diseases of the M inistry of Education，Beijing 100069，China)

ObjectiveTo exp lore the correlation of behavioral changes and survival rate of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta(SNpc)in parkinsonian rat model.M ethods The parkinsonian rat model was established by mechanical transection of the nigrostriatal dopamine pathway at the medial forebrain bundle(MFB). Behavioral studies were carried out by apomorphine challenge.Immunohistochemistry was applied on the tissue sections of substantia nigra(SN).The number of dopaminergic neurons was determined by counting the tyrosine hydroxylase(TH)－positive neurons in the sections.ResultsImmunohistochem ical studies confirmed a significant loss of TH－positive neurons on the lesioned side，while the rotations induced by apomorphine increased remarkably in the parkinsonian rat model..Conlusions At 4 weeks after the surgery，there is a significant inverse correlation between the number of apomorphineinduced rotations and the decreased survival rate of neurons in parkinsonian rat models established by mechanical transection of the nigrostriatal dopamine pathway at the medial forebrain bundle.

Parkinsonian rat model;MFB;Apomorphine;Dopaminergic neurons;Behavioral changes

Q－189

A

1005－4847(2010)05－0394－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.007

2010－04－21

国家自然科学基金(编号:30472245);首都医科大学基础临床科研合作基金(编号:10JL14)。

刘丽敏(1973－)，女，研究方向:帕金森病发病机制及防治研究。E－mail:liulimincn@yahoo.com.cn

王晓民。E－mail:xmwang@ccmu.edu.cn