响应面法优化漂白浆酶水解

吕 健 詹怀宇 付时雨

(华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室,广东广州,510640)

响应面法优化漂白浆酶水解

吕 健 詹怀宇 付时雨

(华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室,广东广州,510640)

采用响应面法中的Box-Behnken实验设计,研究了温度、酶用量和pH值对漂白针叶木浆酶解效率的影响,分别提出了用于预测可溶糖转化率和葡萄糖转化率的数学模型。通过规划求解,优化了3个因素:当温度、酶用量和pH值分别为52.8℃、10 g/L、5.5以及45.9℃、10 g/L、5.3时,可溶糖转化率和葡萄糖转化率分别达到最大81.5%和54.3%。通过实验数据与预测数据的对比,证明模型具有准确的预测性能。

纤维素;漂白浆;酶水解;响应面法

纤维素是自然界中储量最大的可再生聚合物,年产量约为1011～1012t[1]。随着化石能源的日益缺乏、生物质能源的迅速发展,利用纤维素基原料,通过纤维素酶水解产生葡萄糖进而转化为乙醇或能源气的研究引起了人们的极大关注[2-3]。其中,纤维素转化为可发酵的可溶糖和葡萄糖的效率是评价能否工业应用的关键。

纤维素酶解是在一个由纤维素原料、纤维素酶和反应器组成的复杂的固液体系中进行的,因此影响纤维素酶水解的因素也非常复杂[4]。从纤维素原料性质上来说包括纤维素的结晶度、聚合度、表面积等[5-7],从酶的性质上包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的组成与活性[8-9]。从工业上来说,人们更关心工艺条件的影响,主要包括反应温度、pH值、反应时间、底物浓度和酶用量等[10-11]。这些因素并不是单独影响纤维素酶解效率的,因素间存在协同效应。

为了研究工艺因素对纤维素酶解的影响以及协同效应,优化纤维素酶解效率,本实验采用响应面实验设计法研究了温度、酶用量和pH值对漂白针叶木浆酶解效率的影响。响应面法是一种利用数理统计知识,通过数学建模和分析,评估多个自变量单独和同时对因变量影响的方法,其主要目标是利用模型优化因变量的响应[12-13]。响应面曲线法的优点在于能从最少的实验次数中获得最多的信息,其数学模型采用多元二次方程,形式如式(1)所示:

其中,Xi和Xj表示自变量,Y表示响应变量, β0、βi、βii和βij为方程的系数,βi、βii和βij分别代表因素的线性影响、平方影响和因素间的协同影响。在自然科学研究和工程研究中,该方法得到了广泛的应用[1415]。

1 实 验

1.1 实验药品、原料及仪器

漂白针叶浆:取自国内某厂。

纤维素酶:Pergalase7547(来源于Trichoder m a reesei),酶活力12.8 FPU/mL。

总有机碳测定仪(TOC-VCSH,SH IMADZU):日本岛津公司生产。

离散式全自动化学分析仪(DA3500):美国O.I.Analytical公司生产;结合Megazyme公司生产的D-葡萄糖检测试剂包,用于葡萄糖的定量测定。

缓冲溶液:根据实验条件,配置pH值范围为3～7的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。

1.2 实验过程

将漂白针叶木浆分散于不同pH值、浓度0.5mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中,配制成质量浓度10 g/L的纤维悬浮液。加热至预定温度并保持20 min,确保纸浆纤维分散均匀。然后在反应器中加入纤维素酶,保持搅拌速度300 r/min,反应进行24 h后取样,离心过滤后取滤液测定样品中有机碳含量和葡萄糖含量。通过反应前后的有机碳含量和葡萄糖含量计算纤维的可溶糖转化率和葡萄糖转化率。可溶糖包括纤维素降解后溶解在水解液中的葡萄糖、纤维二糖和纤维多糖。

可溶糖转化率Y1(%)计算公式为:

葡萄糖转化率Y2(%)计算公式为:

1.3 实验设计与数据分析

本实验采用响应面法中的Box-Behnken实验设计,主要研究反应温度(X1)、纤维素酶用量(X2)和pH值(X3)3个因素对纤维素酶解过程中可溶糖转化率(Y1)和葡萄糖转化率(Y2)的影响。实验设计和回归分析均在Design Expert(7.1.5,Statease, Inc.,USA)软件中运行。

2 结果与讨论

2.1 初步实验结果

影响纤维素酶水解的工艺因素主要有反应温度、pH值、反应时间、底物质量浓度和酶用量等。初始进行了单因素实验,研究了每个因素对纤维素酶解葡萄糖转化率的影响,以确定各因素的取值范围。

底物浓度的选择与反应器的形状以及搅拌强度有关,本实验以锥形瓶为反应器,置于振荡水浴中进行。由于搅拌强度较弱,为了使反应均一,底物质量浓度不宜太高,本实验中选择10 g/L。实验证明,在本实验条件下,底物浓度太高不利于纸浆纤维的酶解。纸浆纤维的酶解效率随反应时间增加不断增加,只是反应速率逐渐减小。单因素实验证明,反应时间超过24 h后,酶解效率提高幅度已很低。因此,在响应面实验设计中再研究底物质量浓度和反应时间两个因素显得意义不大。因此固定底物质量浓度为10 g/L,反应时间为24 h,在响应面实验设计中仅研究反应温度、酶用量和pH值的影响。

本实验使用的纤维素酶为工业用酶,其酶活较低(12.8 FPU/mL),实验中其用量取值范围较高,为2～10 g/L。反应温度对纤维素酶解葡萄糖转化率影响的单因素实验(酶用量6 g/L,pH值4.8)的结果表明(实验数据略),本实验所选用的纤维素酶最适宜的反应温度在40～60℃之间,在该温度范围之外的葡萄糖转化率明显降低。pH值对纤维素酶解葡萄糖转化率影响的单因素实验(反应温度50℃,酶用量6 g/L)结果表明(实验数据略),在一个较宽的pH值范围(3～7)内,葡萄糖转化率较高,且区别并不大。

根据初始的实验结果,确定下一步响应面实验设计中反应温度的中心点为50℃,步长为10℃;酶用量的中心点为6 g/L,步长为4 g/L;pH值的中心点为5,步长为2。实验设计的变量与取值如表1所示。

表1 漂白浆酶解变量的取值范围

2.2 Box-Behnken实验

根据响应面法中的Box-Behnken实验设计,考察3个自变量时需要17组实验,如表2所示,这些实验是由3个因素不同组合起来得到的。

为了减少系统误差,从实验设计的标准次序中随机抽取,进行了实验序号重排。所有的实验都经过3次测量,取平均值,并且保证相对偏差在5%以内各组实验得到的可溶糖转化率和葡萄糖转化率结果见表2。

从表2结果可知,通过改变温度、酶用量和pH值,可溶糖转化率在40%～80%间变化,葡萄糖转化率在15%～55%间变化。不同的因素组合下,可溶糖和葡萄糖的转化率差异很大。反应温度从40℃提高到60℃,可溶糖转化率提高,但是葡萄糖转化率下降(标准序号1、2,标准序号3、4,标准序号5、6或者标准序号7、8);酶用量从2 g/L提高到10 g/L,可溶糖转化率和葡萄糖转化率都显著提高(标准序号1、3、标准序号2、4,标准序号9、10或者标准序号11、12);pH值从3提高到7,可溶糖转化率和葡萄糖转化率有少许增加(标准序号5、7、标准序号6、8,标准序号9、11或者标准序号10、12)。

表2 Box-Behnken实验设计与结果

2.3 模型的拟合及方差分析

通过对表2中17组实验结果的回归分析,利用式(1)对所有数据进行拟合,得到了表示可溶糖转化率(Y1)和葡萄糖转化率(Y2)的回归方程,分别为:

式(4)和式(5)即为以温度(40～60℃)、酶用量(2～10 g/L)和pH值(3～7)为自变量时,可溶糖转化率和葡萄糖转化率的预测模型。图1和图2分别为可溶糖转化率和葡萄糖转化率的模型预测值与实验值的对应关系,从图1～图2可见预测值与实验值吻合非常好。

为了说明以上两个模型的有效性,利用Design Expert分别对其做了方差分析,可溶糖转化率的方差分析如表3所示。

表3 可溶糖转化率(Y1)模型的方差分析

从表3中看到,可溶糖转化率模型(模型(2))的F检验值为32.7,p值<0.0001,说明该模型是显著的。同时,对模型的Lack of Fit进行检验,其p值为0.1812。当Lack of Fit的p值>0.1时,认为是不显著的,说明模型满足预期假设。因此,该模型在统计上是证明可行的。同时模型中各项的方差分析表明,X1、X2、、和是模型中的显著项(其p值均小于0.05),对因变量Y1起主要影响。方差分析得出,模型的R2值达到0.9768,说明模型具有很高的准确性。

表4为葡萄糖转化率模型(模型(3))的方差分析,同样,其模型的F检验值为158.5,p值< 0.0001,模型Lack of Fit的p值为0.1552,也说明了该模型在统计上的有效性。在对因变量Y2的影响上, X1、X2、X3、X1X2、、和都起显著作用。模型的R2值高达0.9951,具有非常准确的预测性。

表4 葡萄糖转化率(Y2)模型的方差分析

2.4 响应面曲线分析

图3和图4是分别根据数学模型(2)和模型(3),固定其中一个自变量而做出的三维响应面曲线图,直观地表示出了温度、酶用量和pH值3个因素对可溶糖转化率和葡萄糖转化率的影响。

从图3(a)中可以看出,当pH值控制在5.0时,酶用量对可溶糖转化率的影响大于温度的影响。可溶糖转化率随酶用量的增加而增加,但随温度在40～60℃范围内变化时,表现出先增加后减小的趋势,说明在此温度范围内会存在一个最优温度值使可溶糖转化率达到最大值。图3(b)为酶用量为6 g/L时,温度和pH值对可溶糖转化率的影响。同温度一样,随着pH值从3增加到7,可溶糖转化率也先增加后减小。在此图中存在一个明显的顶点,表明在实验的温度和pH值范围内,有一个最佳的组合,使可溶糖转化率最高。图3(c)是温度在50℃时,酶用量和pH值对可溶糖转化率的影响。

图4(a)、(b)、(c)为温度、酶用量和pH值相互对葡萄糖转化率的影响,其与图3(a)、(b)、(c)的形状相似,但峰型有差异,说明3个因素对葡萄糖转化率的影响趋势与其对可溶糖转化率的影响趋势相近,但是影响程度不相同。

2.5 漂白浆酶解影响因素的优化

在实际应用中,为了提高酶解效率,需要优化反应中的可变因素,达到期望的响应值。在固定其他因素时,可以利用模型(2)和模型(3)分别找出一组温度、酶用量和pH值的取值组合,使可溶糖和葡萄糖的转化率达到最高。模型的优化取值使用Excel(Mi crosoftOffice Excel 2007)中的“规划求解”(Solve Tool)工具。求解结果如表5所示。

表5 漂白浆酶解影响因素优化取值

图3 数字模型(2)三维响应面曲线图

图4 数字模型(3)三维响应面曲线图

从表5中可以看出,当温度为52.8℃、酶用量为10 g/L和pH值为5.5时,可溶糖转化率达到最大,为81.5%;当温度为45.9℃、酶用量为10 g/L和pH值为5.3时,葡萄糖转化率达到最大,为54.3%。为了验证此结果,在此优化条件下做了验证实验,实验值和模型预测值的对比如表6所示。从表6可见,在优化条件下得到的可溶糖转化率和葡萄糖转化率的实验值与模型的预测值非常接近,说明模型(2)和模型(3)可准确地优化漂白浆酶解条件。

表6 优化条件下实验值与模型预测值的对比%

3 结 语

本实验利用响应面法中的Box-Behnken实验设计对影响漂白针叶木浆纤维素酶水解的3个主要影响因素(温度、酶用量和pH值)进行了研究。通过回归分析,得出了2个三元二次多项式方程分别用于预测酶解过程中的可溶糖转化率和葡萄糖转化率。方差分析证明模型在统计上是显著有效的,可用于准确预测不同温度、酶用量和pH值条件下的可溶糖转化率和葡萄糖转化率。通过对数学模型的规划求解,得到了使响应变量达到最大的优化条件,分别为:当温度为52.8℃、酶用量为10 g/L和pH值为5.5时,可溶糖转化率达到最大81.5%;当温度为45.9℃、酶用量为10 g/L和pH值为5.3时,葡萄糖转化率达到最大54.3%。验证实验证明了模型优化的准确性。

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Abstract:Box-Behnken design in Response SurfaceMethodologywas employed to study the effects of temperature,cellulase dosage and pH on the efficiency of enzymatic hydrolysis of bleached softwood pulp.Two mathematic modelswere proposed to predict the conversion rates o soluble sugar and glucose.The three parameterswere optimized by solver tool inMicrosoft Excel.The optimal values of temperature,cellu lase dosage and pH formax imum soluble sugar conversion were found to be 52.8℃,10 g/L and 5.5,respectively.Those formaximum glu cose conversion were 45.9℃,10 g/L and 5.3,respectively.Comparing the experimental data and predicted data,the models were con firmed to be of high precision.

Keywords:cellulose;bleached pulp;enzymatic hydrolysis;response surface methodology

(责任编辑:常 青)

Opt im ization of Enzymatic Hydrolysis of Bleached Pulp by Response SurfaceM ethodology

LV Jian＊ZHAN Huai-yu FU Shi-yu

(State Key Lab of Pulp&Paper Engineering,South China University of Technology,Guangzhou,Guangdong Province,510640)
(＊E-mail:lv.jian328@gmail.com)

TS71+1;TP27

A

1000-6842(2010)02-0016-06

2010-01-04(修改稿)

本课题为国家973计划(2007CB210201)资助课题。

吕 健,男,1982年生;在读博士研究生;研究方向:制浆化学与生物化学。

E-mail:lv.jian328@gmail.com