7型腺病毒温州株基因组主要序列的克隆与分析

姜招嫦，赵娜，黄燕燕，余雪姣，彭颖

(温州医学院 检验医学与生命科学学院，浙江 温州 325035)

7型腺病毒温州株基因组主要序列的克隆与分析

姜招嫦，赵娜，黄燕燕，余雪姣，彭颖

(温州医学院 检验医学与生命科学学院，浙江 温州 325035)

目的：克隆和分析7型腺病毒温州株（Ad7wz1）基因组主要序列ITR、E1A261R、E1B55kDa、Hexon和E3。方法：分离并提取了Ad7wz1基因组DNA，PCR扩增得到各基因后利用PMD18 simple T载体进行克隆，并测序分析。结果：获得Ad7wz1 ITR-L、E1A261R、E1B55kDa、Hexon、E3和ITR-R六个基因的克隆，并测得核苷酸序列；分析表明其核苷酸序列和相应的氨基酸序列与GenBank上已发表的Ad7全基因组序列比较同源性分别达到93.2%～100%和97.8%～100%。结论：初步确定本次分离的Ad7wz1毒株为Ad7d2型，Ad7wz1与已经发表的Ad7病毒株序列有高度同源性，为研究Ad7的致病机制提供了重要的理论基础。

7型腺病毒；克隆，分子；序列分析；序列同源性

目前已知的腺病毒（adenovirus，Ad）基因序列血清型约52种，分为A～F六组，其中7型腺病毒（adenovirus type seven，Ad7）属于B组[1]。Ad7与人类的呼吸道疾病密切相关，据WHO调查表明，全世界范围内Ad所导致的人类疾病中，约1/5由Ad7引起，尤其儿童感染Ad7会产生重症呼吸道疾病甚至死亡[2]。腺病毒基因组长约36 kb，其两端各有一个反向末端重复区（inverted terminal repeats，ITR），内侧为病毒包装信号。基因组上含有E1（E1A、E1B）、E2（E2A、E2B）、E3、E4四个早期转录基因。其中E1是表达蛋白参与病毒基因和有关细胞基因的转录，是病毒基因活动的起始因子，E3的基因表达产物与病毒逃避宿主免疫系统有关，为病毒复制的非必需区[3]。Ad7的致病性必定与其特殊的基因结构与功能有关，为此，了解Ad7基因组结构序列，有助于研究Ad7感染致病机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1试剂：限制性核酸内切酶、高保真DNA聚合酶、DNA Marker、PMD18 simple T载体均购于宝生物工程（大连）有限公司；PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；其余试剂均为国产分析纯。大肠杆菌DH5α由我室保存。

1.1.2细胞来源：A549细胞株购自中国科学院上海细胞库，使用含10% FBS的F12培养基（购自Gibco公司）在37 ℃，5% CO2细胞培养箱中培养。

1.2 方法

1.2.1Ad7wz1的分离培养和基因组DNA提取：痰液标本采自温州医学院附属育英儿童医院2岁肺炎患儿，分离得到病毒株Ad7wz1并提取病毒基因组DNA。方法参照参考文献[4]进行。

1.2.2Ad7wz1基因组DNA的限制性核酸内切酶酶切及电泳：病毒基因组DNA分别用BamHI、HindIII和SmaI进行酶切，产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3引物设计并合成：参照发表的Ad7基因组全序列AY495969，利用Primer 5.0软件设计六对PCR引物（见表1）并合成。

表1Ad7wz1病毒株主要基因片段的引物序列、酶切位点及所在基因组位置

1.2.4分子克隆及测序：PCR扩增ITR-L、E1A261R、E1B55kDa、Hexon、E3、ITR-R六个片段。所得PCR产物与PMD18 simple T载体连接并转化大肠杆菌DH5α，在氨苄霉素平板上筛选转化菌。重组子经限制性内切酶双酶切鉴定后送大连宝生物测序。

1.2.5序列分析：将测序后的各段序列与已在GenBank发表的五个Ad7基因组序列进行BLAST比对，并用BioEdit软件进行核苷酸和氨基酸的同源性分析。这五个基因组序列分别是：Adref1：AY495969，Adref2：AY601634[5]，Adref3：AY594256[6]，Adref4：AY594255，Adref5：BK005235。

2 结果

2.1 腺病毒感染A549细胞A549细胞感染痰液腺病毒5～7d后即引起细胞肿胀、变圆、聚集成葡萄串珠状的典型细胞病变（图1A、图1B）。

图1腺病毒感染A549细胞后的细胞病变效应

2.2 病毒基因组DNA的酶切图谱病毒基因组DNA的BamHI、HindIII和SmaI酶切图谱（见图2），对照国外文献，从BamHI的带型初步确定本次分离的Ad7wz1毒株为Ad7d2型[7]。

图2 病毒基因组DNA的酶切图谱

2.3 Ad7wz1主要基因克隆的获得按常规PCR法扩增出六个片段分别为：ITR-L（500 bp）、E1A261R（780 bp）、E1B55kDa（1400 bp）、Hexon（250 bp）、E3（1200 bp）、ITR-R（514 bp）。纯化后产物与PMD18 simple T载体克隆后用相应限制性核酸内切酶酶切鉴定，结果均与预期大小一致（见图3A～F）。

2.4 序列比对及同源性分析Ad7wz1与Genbank上已发表的五个Ad7基因组相应序列比较结果表明：核苷酸序列的同源性分别达到97.8%～99.6%、99.1%～100%、98.9%～99.9%、100%、98.8%～99.6%、93.2%～96.1%（见图4A）；相应E1A261R、E1B55kDa、Hexon、E3区的氨基酸序列同源性分别达到99.2%～ 100%、98.6%～99.8%、100%、97.8%～99.8%（见图4B）。

图3Ad7wz1 ITR-L、E1A261R、E1B55 kDa、Hexon、E3、ITR-R基因PCR及酶切鉴定图

图4AAd7wz1主要基因与Genbank上已发表的Ad7基因组相应序列核苷酸同源性比较

图4BAd7wz1主要基因与Genbank上已发表的Ad7基因组相应序列氨基酸同源性比较

2.5 基因序列突变位点分析Ad7wz1主要基因编码区对应五组参照基因组序列普遍存在的突变位点有：E1A261R区第613位T突变成C，造成苯丙氨酸突变成丝氨酸；E1A261R区第744位C突变成G，造成谷酰胺突变成谷氨酸；E1B55kDa区第2008位G突变成A，造成精氨酸-赖氨酸；E3区30579-30581（参照Ad7ref1）位点与Adref1、Adref2、Adref4、Adref5比较都发生C、T、A三个碱基连续缺失，造成移码突变（见图5）。

图5Adwz1 E1A261R、E1B55KDa、E3编码区基因主要突变位点

3 讨论

Li等[8]于上世纪80年代用DNA限制性酶切分析的方法，对Ad7的分子流行病学进行研究，建立了基因组分型方法并从基因水平上阐述了Ad7的流行特点。本研究分离的野生型腺病毒毒株经酶切图谱分析初步确定为为Ad7d2型。Ad7d2首先在以色列分离到，1995年在日本、1998年在美国也出现了Ad7d2的流行[7]。本研究报告Ad7d2病毒株的分离和鉴定，对Ad7d2在我国的流行趋势分析和致病机制研究具有重要的意义。

我们利用PMD18 Simple T载体克隆了Ad7wz1基因组主要片段并测序分析，结果表明Ad7wz1与GenBank上已发表的Ad7基因组相应核甘酸序列和氨基酸序列比较同源性分别达到93.2%～100%和97.8%～100%，由此看出Ad7wz1与这五组基因组有着高度同源性，为研究Ad7的致病机制提供了重要的理论基础。通过序列比对，编码区基因共有4个位点的核酸突变普遍存在并导致了氨基酸变异。E3区在30579-30581（参照Ad7ref1）位点发生连续缺失并造成氨基酸变异的情况比较普遍，E3区的序列分析是我们研究Ad7基因组结构变化导致免疫原性变异的基础，这有助于我们深入分析E3区基因及其表达产物的变异对细胞免疫分子表达的影响。

[1]Zhang QW, Su XB, Seto D, et al . Construction and characterization of a replication competent human adenovirus type 3-based vector as a live-vaccine candidate and a viral delivery vector [J]. Vaccine,2009,27(1):1145-1153.

[2]Purkayastha A, Su J, Carlisle S,et al. Genomic and bioinformatics analysis of HAdV-7, a human adenovirus of species B1 that causes acute respiratory disease: implications for vector develop-pment in human gene therapy [J]. Virology,2005,32(12):114-129.

[3]Luo JY, Deng ZL, Luo XJ, et al.A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system [J]. Nature Protocols,2007,2(5):1236-1247.

[4]沈鑫烽,申宝玲,黄燕燕,等.7 型腺病毒E1A 基因克隆及真核表达[J]. 细胞生物学杂志,2008, 30(2):196-200.

[5]Malanoski AP, Lin BC, Stenger DA, et al. A model of basecall resolution on broad-spectrum pathogen detection resequencing DNA microarrays[J]. Nucleic Acids Res,2008, 36(6):3194-3201.

[6]Purkayastha A, Ditty S E,Su J, et al. Genomic and bioinformatics analyses of HAdV-4vac and HAdV-7vac, two human adenovirus (HAdV) strains that constituted original prophylaxis against HAdV-related acute respiratory disease, a reemerging epidemic disease[J]. J Clin Microbiol,2005,43(7): 3083-3094.

[7]Cook JL, Miura TA, Ikle DN, et al. E1A oncogene-induced sensitization of human tumor cells to innate immune defenses and chemotherapy-induced apoptosis in vitro and in vivo[J]. Cancer Res,2003,63(12):3435-3443.

[8]Li QG, Henningsson A, Juto P,et al. Use of restriction fragment analysis and sequencing of a serotype-specific region to type adenovirus isolates[J]. J Clin Microbiol,1999,37(3): 844-847.

（本文编辑：吴健敏）

Cloning and analysis of main sequences of adenovirus type 7 Wenzhou strain genome

Jiang Zhaochang，Zhao Na，Huang Yanyan，Yu Xuejiao，Peng Ying.School of Laboratory Medicine and Life Science，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective: To clone and analyze of main sequences of adenovirus type 7 Wenzhou strain genome(Ad7wz1)，including ITR，E1A261R，E1B55kDa，Hexon，and E3. Methods:Ad7wz1 genome was isolated and purified， each gene putting into PMD18 simple T vector after amplified by PCR was cloned，then sequenced. Results:Six genes of Ad7wz1，including ITR-L，E1A261R， E1B55kDa，Hexon，E3 and ITR-R were cloned. The result of sequencing showed that the homology of the nucleotide sequence was 93.2%～100% and the homology of the commensurate amino acid sequence was 97.8%～100% after comparied with genomewide sequence of the Ad7 strain reported in GenBank. Conclusion:Ad7wz1 is ascertained as type Ad7d2 initialy，which shows a high homology with corresponding region of Ad7 strain reported，it affords the important theoretical basis for research on Ad7 pathogenesis.

adenovirus type 7；cloning molecular；sequence analysis；sequence homology

book=7,ebook=10

R373.1；Q78

A

1000-2138 (2010)04-0339-04

2009-09-22

浙江省自然科学基金资助项目(Y205188)。

姜招嫦（1986-），女，浙江温州人，硕士生。