环介导等温扩增技术在转基因饲料成分检测中的应用

内蒙古农业大学动物科学学院 田 芳

农业部饲料生物技术重点实验室

中国农业科学院饲料研究所基因工程研究室 王秀敏 滕 达 杨雅麟 敖长金 王建华＊

目前全球种植面积最广泛的商业化转基因作物为大豆、玉米、棉花和油菜，2009年全球转基因农作物播种面积达3.3亿英亩。在美国，约91%大豆作物、85%玉米作物均为转基因品种（Clive James，2009），60% ～70%饲料原料由转基因作物及其副产品组成（OECD，2003）。2009年，美国向中国出口的3130万吨大豆几乎全部为转基因产品，随着转基因作物在饲料领域的广泛应用，研究新的转基因成分检测方法对我国饲料行业的科学监管、建立转基因产品标识制度、转基因安全评价以及国内外贸易都有重要意义。环介导等温扩增 技 术 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等（2000）建立的一种新型恒温核酸扩增方法，利用自动循环的链置换反应，在等温条件下，不到1 h就能扩增出109个靶序列拷贝。该方法不需PCR仪和昂贵试剂，产物可肉眼观察（肖斌等，2005），已广泛应用于人畜细菌、病毒等病原体诊断、动物胚胎性别鉴定和转基因食品检测等领域 （Zablon等，2010）。 本文在综述LAMP技术原理和特点的基础上，展望了其在饲料检测中的应用前景。

1 LAMP技术原理和特点

1.1 LAMP的原理 等温扩增反应是针对靶序列上6个独立区域 （3′端的F3c、F2c和F1c区以及5′端B1、B2和B3区）设计4种特异引物，包括两对特殊内引物 （FIP由F1c和F2组成，F2与靶序列 3′端 F2c区互补，F1c区与靶序列 5′端 F1c区序列相同；BIP由B1c和B2组成，B2与靶序列3′端的B2c区互补，B1c区与靶序列 5′端的 B1c区序列相同）和外引物（F3，与靶序列的F3c区互补；B3，与靶序列的B3c区互补），利用一种高活性链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件（60～65℃）保温1 h，即可完成靶基因的高效扩增，直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度或荧光染料染色后的颜色变化来判断反应结果（Parida等，2006），4条引物与 6个区域的配对确保了该反应的较高特异性 （Fukuta等，2004）。LAMP反应包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段（Notomi等，2000）。反应起始阶段，内引物BIP的B2序列与模板的B2c区结合，在Bst聚合酶作用下延伸复制一条新链，随后外引物B3与模板的B3c区结合，一边延伸形成互补链，一边置换出内引物BIP合成的DNA链，最终B3引物形成的DNA链与模板DNA形成双链，而最初BIP合成的DNA链以单链形式被置换出来，其5′末端B1c与该链B1互补配对形成环状结构。同时内引物FIP以该单链为模板与之结合形成互补链，此时环状结构被打开，接着F3引导合成BIP引物合成链的互补链，置换出FIP引物合成的链，该链5′末端进行碱基互补配对形成环状结构，以3′末端B1区为起点，自身为模板进行DNA合成延伸，形成哑铃状结构，此为LAMP循环扩增反应起始物。在循环扩增阶段，以茎环结构为模板，BIP引物B2与哑铃结构上B2c杂交结合，开始新一轮链置换合成，同时从环状结构3′端F1区为起点进行DNA合成延伸，同样置换出的单链也会形成环状结构，以3′末端的F1区为起点，自身为模板进行DNA合成延伸及链置换，形成长短不一的两条新茎环结构的DNA，FIP引物与其F2c区结合，开始新一轮的扩增，产物长度增1倍。如此反复循环，形成由不同长度和不同个数花椰菜形状的茎-环结构的DNA组成的混合扩增产物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列，电泳图谱为不同大小区带组成的阶梯式条带状。

1.2 LAMP的特点 （1）易操作，速度快。LAMP是等温扩增反应，无需昂贵仪器，水浴锅即可，适于医疗机构和检测部门。因无热变性反应可在1 h内完成，若添加环状引物则可在30 min内检测到扩增产物，且产物可用肉眼观察或浊度仪检测。若加入逆转录酶，则能实现RNA一步扩增。（2）灵敏度高，特异性强。由于4条引物必须与靶序列上的6个区域完全匹配才能保证扩增反应进行，因此特异性强。在病毒检测中，扩增模板可达1～10个拷贝，灵敏度极高。有研究表明，LAMP比PCR法更具有选择性和扩增效率，DNA产量可达500 μg/mL （Seki等，2005）。 （3）引物设计方便登陆LAMP技术在线引物设计网站http：//primerexplorer.jp/e/，只需导入靶序列即可自动生成优化引物，同时遵循引物设计的一般原则。（4）局限性靶序列长度最好控制在300 bp以下，大于500 bp则较难扩增。引物设计是LAMP技术的关键，设计不当即会出现假阳性或假阴性，出现非特异性扩增且不易鉴别。由于灵敏度高，操作时要严谨，避免污染。

2 LAMP技术的改进及其在转基因饲料成分检测中的应用

2.1 LAMP的技术改进 虽然LAMP方法比PCR反应速度快，但是与临床常用的免疫层析等免疫学技术相比，所需时间还是较长，为了满足临床需要，人们从各方面改进并完善LAMP技术。Nagamine 等（2002）研究表明，通过在 F2、F1 之间和B2、Bl之间增加2条环状引物可将LAMP所需的反应时间缩短近一半。同样，Yano等（2007）在对肠毒素大肠杆菌的检测研究中，通过加入环状引物的方式使扩增时间从60 min缩至35 min。由于LAMP反应产物可通过凝胶电泳、产物染色和反应产物是否浑浊来检测，Maeda等 （2006）在对牙龈卟啉单胞菌的检测中发现，琼脂糖电泳和SYRB Green I的检测极限相近，直接沉淀观测法则低10倍。LAMP与其他技术联合使用使得检测结果更为有效。申建维等（2006）研究表明，将核酸杂交和LAMP技术相结合，建立了多重分子信标LAMP快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，在反应中两种不同荧光探针分别与mec A和fem A基因的扩增产物互补序列结合，最后检测反应管中的两种荧光值。结果显示此方法的最低检测限为10 CFU/mL，与药敏实验结果比较，灵敏度99.0%，特异度90.9%，证明该方法灵敏度高、特异性强、操作简便快速，适用于临床样品的直接快速基因检测。

2.2 LAMP在转基因饲料成分检测中的应用目前，LAMP技术已逐渐运用到转基因作物及其成分的检测研究上，如对转基因大豆的检测。Shiro等 （2004）建立了针对CaMV-35启动子的LAMP检测方法，可在转基因大豆及其产品中检测到含量为0.5%～5%的转基因成分。由于95%转基因植物产品含35 S启动子，故该法可初检转基因成分。兰青阔等（2008）研究了检测转基因抗草甘膦大豆的LAMP技术，针对CP4-epsps合成酶基因的6个区域设计4条特异性引物，建立了针对转基因大豆CP4-epsps基因的LAMP检测方法，荧光显色结果表明该方法能特异性检测外源基因，灵敏度是常规定性PCR方法的10倍，具有高度的特异性及稳定性，适合转基因抗草甘膦大豆的快速检测。刘彩霞等(2009)优化LAMP反应条件，快速、灵敏、有效地检测转基因大豆及加工品中整合的EPSPS基因，检测下限为0.01%，低于国际现行最低检测量0.5%的要求，可对抗草甘膦转基因大豆及加工品进行定性检测。Lee等（2009）对转基因油菜的烟草花叶病毒35 S启动子，胭脂碱合成酶基因启动子和终止子进行LAMP检测，可从单拷贝模板中检测到转基因成分，检测限也为0.01%，表明该方法适于多种转基因植物产品的检测。

3 小结

综上所述，LAMP技术在简便性、快速性和敏感性方面均具优势，可用于饲料中转基因成分检测，但由于饲料成分复杂，提取高纯度的DNA难度加大，而各种饲料加工工艺又使DNA片段在高温高压下可能发生降解，且温度越高，加热时间越长，降解越明显（Patrizia等，2009），这些对外源基因产生的影响，都会延长检测周期，影响检测结果。因此针对外源基因在饲料加工过程中的变化和多种成分的干扰，优化完善检测技术参数，将有利于推动LAMP在转基因饲料快速检测中的应用。这对于建立转基因产品标识制度，完善转基因产品使用、动态监控和积累基础数据都具有重要意义。

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