瘤胃微生物多样性与分析技术的研究进展

中国农业科学院饲料研究所 符运勤 刁其玉 屠 焰＊

1 瘤胃微生物区系及其作用

反刍动物瘤胃内栖息着复杂、多样、非致病的各种微生物，包括瘤胃原虫、瘤胃细菌和厌氧真菌，还有少数噬菌体（冯仰廉，2004）。瘤胃微生物的种类极为多样，每毫升瘤胃内容物中有不同种类细菌1010～1011个、原虫105～106个、厌氧真菌（游离孢子数为103～105，包括6个属）和噬菌体（颗粒数为 105～ 106个）（王梦芝等，2008）。 它们在反刍动物瘤胃发酵过程中起着关键作用，所以研究瘤胃微生物区系对提高反刍动物的饲养管理水平和生产性能有重要意义。

反刍动物出生时其消化道不存在厌氧细菌、厌氧真菌和原虫，而后随着与母体及环境的不断接触，瘤胃及其他消化道部位逐渐建立微生物区系。细菌是最早出现在瘤胃中的微生物，动物出生24 h后其瘤胃壁即有兼性厌氧细菌等存在，出生2 d后瘤胃内出现严格厌氧微生物。在成年前，反刍动物瘤胃内细菌菌群发生很大变化 （冯仰廉，2004）。经过适应和选择，只有少数微生物能在消化道定植、存活和繁殖，并随幼畜的生长和发育，形成特定的微生物区系（冯仰廉，2004）。瘤胃微生物间相互作用，维持瘤胃功能的稳定，瘤胃微生物区系保持动态平衡是保证瘤胃健康的前提。因此，对反刍动物生长过程中瘤胃微生物的发生、发展进行研究，了解瘤胃代谢和微生物之间的关系，并进行有益的调控，将促进反刍动物瘤胃健康发育，从而保障成年后的生产性能，也为合理应用饲料、开辟新的饲料资源提供理论依据。

2 瘤胃微生物区系的多样性与分析技术

2.1 瘤胃微生物多样性的研究 早期对瘤胃细菌的研究基于人工培养的方法，存在一定的局限性。当前人们对瘤胃中微生物的认识只有10%～20%，随着科学技术的进步，现代分子技术也开始逐渐渗透到瘤胃微生物的研究中来，大大推动了瘤胃微生态领域的研究。近年发展起来的免培养结合16S rDNA的变性梯度凝胶电泳方法逐步克服了常规培养方法的不足（Muyzer，1999）。前人利用分子生物学技术的优势分别对犊牛、成年奶牛和羊等进行了瘤胃微生物多样性的研究。

2.1.1 犊牛瘤胃微生物多样性 于萍等（2009）测定了60～120 d犊牛胃肠道纤维分解菌，认为脂解厌氧弧杆菌是犊牛断奶后消化道中的优势菌之一，不仅是十二指肠中唯一检测到的菌群，而且在其他肠道中的数量也超过琥珀酸丝状杆菌、白色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌等。在瘤胃、十二指肠、空肠和回肠等前段消化道中均未检测到黄色瘤胃球菌，仅在后段肠道结肠和盲肠中检测到该菌的存在。而龙淼等（2009）利用传统培养法和分子生物学定量法对犊牛瘤胃干酪乳杆菌进行分离鉴定并对其相关耐酸基因进行克隆，为下一步研制瘤胃微生态制剂及构建瘤胃内耐酸的乳酸分解基因工程菌奠定了基础。

2.1.2 成年奶牛和成年肉牛瘤胃微生物多样性王远亮等（2005）采用免培养技术对常规饲养条件下奶牛瘤胃微生物多样性进行了初步分析，通过对瘤胃微生物16S rDNA序列的分析，初步构建了部分瘤胃微生物的系统发育树，为更好地利用瘤胃微生物基因资源和奶牛营养研究提供了一些基本数据和材料。而巩庆亮等（2008）采用PCR-16S rDNA鉴定和动态检测奶牛瘤胃液细菌种类，共分离到56株，对其中7株具有代表性的细菌进行了PCR扩增，经序列同源性比较，最终把细菌鉴定为牛链球菌（A0625、A1212、0131）、蜡样芽孢杆菌（0113）、地衣芽孢杆菌（0091）、短小芽孢杆菌（0083）和嗜热链球菌（0123）。 裴彩霞等（2008）采用3对古菌特异性引物扩增瘤胃古菌16S rRNA基因分别建立克隆库来研究晋南牛瘤胃古菌的多样性，试验结果提示瘤胃中存在大量的未知产甲烷菌。

2.1.3 不同品种羊瘤胃微生物多样性 石鹏君等（2007）采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术对波尔山羊、内蒙古绒山羊、四川南江黄羊瘤胃细菌优势菌群结构进行了比较分析，发现14条16S rDNA序列中有4条克隆的序列与基因库最相似菌的相似性大于97%，其中13条与未鉴定菌或未培养菌的序列相似性最高，说明瘤胃中存在着丰富的未鉴定或不可培养细菌种类。从中可以发现3种山羊瘤胃细菌具有一定的相似性，种内个体间相似性明显高于种间相似性，这说明寄主品种是影响瘤胃细菌种群构成的一个重要因素。

综合反刍动物瘤胃微生物区系的研究来看，人们利用传统与免培养技术对犊牛、成年奶牛、肉牛、羊瘤胃优势菌群、瘤胃微生物多样性和瘤胃中微生物的功能基因进行了部分研究并取得了一定进展，但对反刍动物瘤胃中菌群的建立，特别是随月龄、日粮形态的动态变化规律上的报道很少。随着对反刍动物瘤胃微生物研究的深入，对犊牛和后备牛瘤胃微生物区系的研究将显得越来越重要，而现代分子生物学技术的发展和应用为此提供了技术上的保障。

2.2 瘤胃微生物区系分析技术 研究瘤胃微生物区系的方法一般分为瘤胃微生物传统定量方法（滚管计数法和最大或然数法）和分子生物学定量方法（郭同军等，2009）。

2.2.1 传统定量方法 采用Hungate（1969）发展起来的厌氧培养技术，以及采用模拟瘤胃环境而设计的培养基，对瘤胃微生物进行分离、纯培养、计数、形态鉴定、生理生化特性的鉴别、分类等。瘤胃细菌与真菌的数量用显微镜直接计数，常采用滚管法计数，以及最大或然数计数法（most probable number，MPN）。

2.2.1.1 亨盖特厌氧滚管技术 亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。通过此培养技术可以研究瘤胃微生物的多样性，杨舒黎（2007）采用滚管法研究了日粮中添加胡麻油和豆油对奶牛瘤胃纤维分解菌、蛋白分解菌、淀粉分解菌和总细菌数量变化。但此培养技术还存在局限性，因为大多数瘤胃微生物都是厌氧的，而保持绝对厌氧条件是一件很难办到的事，非常不经济，正因为如此，目前在实验室能纯培养出的瘤胃微生物是有限的，纯培养技术还有待改进。

2.2.1.2 最大或然数（MPN）计数法 MPN法适用于测定微生物群落中不占优势、但具有特殊生理功能的微生物类群的数量。 广泛用于测定土壤、水体等环境中氨化、硝化、反硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化等特殊微生物生理类群和藻类的数量，以及牛奶等食品中的特殊微生物类群（如大肠杆菌）的数量；还可用于检测环境中某些基因工程菌株的数量 （崔战利等，2005）。Dehority等（1989）首次将MPN用于瘤胃细菌计数，结果发现该法与滚管法的总细菌数无差异；Theodorou等（1990）将改良的MPN用于瘤胃厌氧真菌的计数，研究结果表明，MPN法计数结果与滚管法相似，但与游动孢子直接记数的结果有很大差异。最大或然数对接种等试验技能要求较低，液体培养基制备和接种所需时间较短，可直观观察生长情况，最终pH也易于检测。此外，MPN法对液相和固相中的真菌均能可靠计数，对产生游动孢子少的厌氧真菌的计数更适用。MPN的缺点是不能对微生物进行分离研究。

2.2.2 分子生物学定量方法 随着人们对瘤胃微生物原位生存状态的研究，发现常规的分离培养方法很难全面地评估微生物群落多样性。从瘤胃中简单提取和厌氧培养计数，不能得到微生物在瘤胃生态系统中的生活特征和生态功能的信息。20世纪80年代以来，以小核糖体RNA16S rRNA为主的分子生物学技术的发展，用分子生物学方法研究瘤胃微生物生态克服了基于培养方法带来的局限，加快了对瘤胃微生物群落的了解。

2.2.2.1 变性 （或温度）梯度凝胶电泳 目前DGGE技术已经成为微生物群落遗传多样性和动态性分析的强有力工具，在微生物生态学领域中广泛地应用于比较微生物群落的多样性和监视种群动态（淡瑞芳等，2007）。DGGE技术对瘤胃细菌的研究主要集中于分析瘤胃细菌的多样性、比较不同品种动物瘤胃细菌的多样性和研究不同饲养条件对瘤胃细菌的影响 （谢林君等，2009）。DGGE技术优点是无需进行体外培养，直接利用微生物样品中的DNA或RNA对微生物群体加以区别，可以很准确地判断出它们之间的种属关系，甚至还可能发现尚未分离鉴定的微生物。但不足之处是它只能检测微生物区系中数量上的优势种，在总DNA模板中某一种微生物的DNA含量小于1%时，难以用其检测出来；另外，它只能对不同种的微生物DNA序列进行分离，而不能确定各DNA序列中突变的位置及相关信息，最终还得依赖于DNA测序分析（李启琳等，2008）。

2.2.2.2 基于16S/18S rRNA的核苷酸 （基因）探针杂交技术定量瘤胃微生物 点杂交和狭线杂交技术是一种分子生物学的标准技术，最早出现于1979年，是将原始样品中的总RNA或几种核酸样品分别定量固定在固相支持物 （尼龙膜或纤维素膜）上，然后用特异的探针与样品杂交，通过估计样品点信号强度，与已知浓度的标准品信号强度进行比较，确定待测样品中靶序列的量；也可通过通用探针和特异探针在相同条件下分别对同一样品进行杂交后的相应信号强度比来计算特异探针所对应的靶RNA占通用探针所对应的靶RNA的百分含量。王海荣等（2006）利用定量杂交法检测绵羊瘤胃纤维细菌，试验将提取的总RNA浓度系列稀释后与通用细菌探针进行杂交，检测结果所做的回归分析表明，杂交信号与尼龙膜上的所点的量具有明显线性关系。同时对几份瘤胃样品进行种纤维分解菌的初步定量检测，结果显示种纤维分解菌的相对丰度与前人报道相似，表明该方法能够对瘤胃细菌进行定量分析，可在后续相关研究中使用。但分子杂交法结果重现性差，导致试验结果不可靠。

2.2.2.3 其他分子生物学定量方法 随着分子生物学的发展，还出现了一些其他的微生物多样性的定量方法。主要有荧光原位杂交（FISH）技术、定量PCR和流式细胞计量术定量检测等先进手段。分子生物学技术的应用，在许多方面改善了传统的研究方法。应用鉴于16S rRNA的方法研究瘤胃细菌及真菌的多样性，使得许多原来难以培养的菌株得以发现。

传统的厌氧培养方法只能认识一小部分瘤胃微生物，大部分微生物不能培养，使得瘤胃微生物多样性严重被低估，而且要求条件比较高，比如要求严格厌氧，费时费力。随着分子生物学技术的发展，16S/18S rRNA/rDNA已经成功地用于瘤胃微生物生态研究中，通过 DGGE、杂交、FISH、竞争PCR和实时定量PCR来检测微生物区系的变化，确定瘤胃微生物特别是细菌的数量。但这些分子技术也有其自身局限性，DGGE只能检测微生物区系中数量上的优势种，在总DNA模板中某一种微生物的所有DNA含量小于1%时，难以用其检测出来；如果以1010个/mL瘤胃食糜计算，分子杂交方法最低检测到总菌的0.01%，而竞争PCR可检测到总菌的0.00001%。但目前由于可利用的寡核苷酸的探针数量很少，所以分子杂交获得的信息是十分有限的。对于竞争性PCR，由于很难建造内标，因此应用性不强，而实时定量PCR比传统PCR是一种很有希望的研究手段，在微生物的定量中有很光明的应用前景。分子生物学技术的优越性并不能完全取代传统培养来研究瘤胃微生物，两种方法应在研究瘤胃微生物多样性中相辅相成。

2.3 益生菌对瘤胃发育的促进作用

2.3.1 瘤胃发育与微生物之间相互依赖 犊牛瘤胃的发育受多种因素影响，如犊牛日龄、饲料组成及形态、挥发性脂肪酸、瘤胃的pH值以及瘤胃微生物等，这些因素相互作用、相互牵制，共同影响瘤胃的形态发育。其中饲料组成及其物理形态是外因，瘤胃食糜pH值变化是内因，挥发性脂肪酸的组成比例不同是直接原因，而瘤胃微生物变化是根本原因（张海涛等，2008）。可见瘤胃微生物区系的建立和保持动态平衡是瘤胃发育之关键，因此为保障反刍动物瘤胃微生物健康，前人采用各种方法来调控瘤胃，其中包括控制原虫数量来调控瘤胃发酵、通过基因工程改造瘤胃微生物和添加瘤胃调控剂。瘤胃调控剂用得较多的有微生物制剂、脲酶抑制剂、离子载体、矿物质元素、维生素以及醚类化合物卤代物等。微生物制剂用得较多的是活性酵母添加物，枯草芽孢杆菌和一些复合菌制剂，这些微生物制剂以其无污染、无残留和明显的作用效果已引起了很多研究者的关注。

大量研究及生产实践证明，益生菌能维持动物胃肠道菌群平衡，调节微生物区系；也有报道说在幼龄动物日粮中添加益生菌能够影响动物消化道中的固有菌群种类及数量，进而提高动物的免疫力。对益生菌作用机制认识目前有：（1）加强黏膜屏障；（2）抗菌效应；（3）影响免疫系统；（4）抑制肠道疾病（许珂和魏萍，2009）。但由于目前的技术方法研究益生菌难度大，对这些机制还不是很清楚。

2.3.2 益生菌对瘤胃微生物的作用 研究证实，在动物饲料中添加益生菌可增强机体免疫功能，保持肠道微生态平衡、防治畜禽疾病，促进畜禽生长、扩大饲料来源、提高饲料转化率，净化环境、改善畜禽产品品质，并可减少或取代抗生素的用量。研究表明，在产奶牛饲料中投入地衣芽孢杆菌培养物能够为奶牛提供比较好的瘤胃微生物生长因子，提高奶牛瘤胃细菌总数，降低其氨态氮浓度，提高瘤胃微生物对氨的利用，提高总挥发性脂肪酸产量和乙酸丙酸比例，降低瘤胃发酵的甲烷产量，在生产性能上则表现为提高产奶量和乳蛋白含量（乔国华和单安山，2008）。日粮中添加纳豆芽孢杆菌，可促进断奶后犊牛瘤胃及肠道中主要的纤维分解菌琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌和脂解厌氧孤杆菌在消化道中的定植和生长；而饲喂产奶牛时具有提高产奶量、改善乳脂率、提高乳蛋白率、增加牛奶中干物质含量和降低牛奶中体细胞数的作用 （栾广春等，2008）。其他益生菌方面，Chaucheyras-Durand等（2008）在对酵母菌及其培养物的研究中发现，活性干酵母对幼龄反刍动物瘤胃微生物的活性有积极作用，可以维持瘤胃pH稳定和防止瘤胃酸中毒，同时提高生长性能和瘤胃纤维分解菌的活性；酵母培养物可以改善荷斯坦犊牛胃肠道内环境，促进消化，提高犊牛对日粮粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的全消化道消化率，因此可以提高平均日增重、改善体尺指标（闫晓刚等，2005）；米曲霉提取物和酿酒酵母发酵产物提高了水牛牛犊营养物质肠道表观消化率，同时日增重也有所提高（Di Francia等，2008）；在绵羊上酵母添加物可减少瘤胃甲烷产生，延缓精料和干草饲粮下绵羊瘤胃能量的释放（Mwenya等，2004）。而饲喂羔羊单一和复合活酵母培养物均可提高瘤胃微生物蛋白的合成，改善饲料转化率，羔羊日增重分别提高了21%和 16%（Tripathi和Karim，2010）。

3 结束语

瘤胃微生物对瘤胃发育有很重要的作用，但目前在犊牛、青年牛瘤胃发育，尤其是微生物区系发生、发展上的研究尚不完善，因此，对于反刍动物瘤胃系统，从简单到复杂，需要开展系统的犊牛-青年牛瘤胃微生物的发生发展研究。而近代分子生物学技术的发展，为研究瘤胃微生物提供了更为有效、简便的方法，也为逐步打开“瘤胃黑箱”提供了可能。

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