肝素钠对肢体缺血/再灌注损伤大鼠肠系膜微循环的保护作用*

孔小燕,宓士军,赵 霞,董淑云,王银环,张 娜,门秀丽,张连元

(1.华北煤炭医学院病理生理教研室,唐山 063000;2.唐山市丰润区医院骨科,唐山 064000)

肢体缺血/再灌注损伤在临床是一种常见的损伤,本实验室多年来以结扎大鼠后肢阻断血流数小时再给予松解恢复血供为方法,制作典型的肢体缺血/再灌注损伤模型,模拟临床断肢再植手术后、严重肢体挤压伤或四肢大血管血栓形成再通治疗后等情况,系统研究了再灌注损伤时远隔器官的损伤机制。本实验拟从再灌注时全身微循环的改变角度探讨远隔器官损伤的发生机制,并同时观察肝素对再灌注时微循环的影响,以期为临床治疗肢体缺血/再灌注损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Wistar大鼠20只,体重(240±10)g,由华北煤炭医学院实验动物中心提供。

1.2 模型制作及分组

大鼠LI/R模型应用本实验室常规方法[1,2],将大鼠双后肢根部用止血带结扎,完全阻断血流,4 h后松解止血带,恢复双后肢血流,肝素组(H组)于松解止血带前30 min于阴茎静脉内注射肝素1 000 U/kg(1 ml/kg),缺血/再灌注组(I/R组)于相同时间注射等量生理盐水,两组动物均于再灌注2 h时自腹腔注射20%乌拉坦(5 ml/kg)麻醉,然后沿大鼠右侧腹部做一纵形切口,打开腹腔,轻轻拉出回盲部肠袢,固定于微循环显微镜载物台的恒温灌流盒上,显微镜与BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)连接,用以观察和记录小肠微循环变化。10 min从腹主动脉取血处死动物。

1.3 肠系膜微循环观测指标

肠系膜微动脉血流速度(arteriole flow velocity,AFV)和微静脉血流速度(venule flow velocity,VFV),微动脉管径(microvascular arteriole diameter,AD)和微静脉管径(microvascular venule diameter,VD)。

1.4 血流变观测指标

血浆黏度(plasma viscosity,ηp)、全血低切还原黏度(low shear reduction viscosity,Lηre)、全血高切还原黏度(high shear reduction viscosity,Hηre)、红细胞压积(hematocrit,Hct)、红细胞聚集指数(erythrocyte aggregation index,EAI)、血沉方程K值(erythrocyte sedimentation rate K,ESRK)、红细胞刚性指数(erythrocyte rigidity index,TK),红细胞变形指数(erythrocyte deformability index,EDI),应用SA-6000全自动血流变检测仪(北京赛科希德公司)检测以上指标。

1.5 血清中 P-选择素和ICAM-1的检测

实验结束前从大鼠腹主动脉取血5 ml,置于EDTA抗凝试管中迅速离心取上清液于-20℃冰箱中冻存。采用ELISA方法检测血清中P-选择素和ICAM-1的含量,ELISA试剂盒购自天津灏洋生物制剂公司,操作严格按照说明书步骤,在美国Bio-rad 550型酶标仪上读取结果。

1.6 统计学处理

2结果

2.1 肠系膜微循环观测情况

大鼠LI/R后肠系膜微循环较正常大鼠有特征性改变[5],主要表现为肠系膜微动、静脉管径扩张,血流速度减慢,微血管中大量白细胞贴壁、粘附,白微栓形成增多,部分毛细血管闭塞、血流停滞,伴管周出血现象。肝素组肠系膜微动脉管径(AD)静脉管径(VD)较单纯缺血/再灌注损伤组明显减小(P＜0.01),而微动脉血流速度(AFV)和微静脉血流速度(VFV)较对照组明显增快(P＜0.01,表1)。

2.2 血流变各项指标

肝素组血浆黏度(η p)、全血低切还原黏度(L η re)、全血高切还原黏度(Hη re)、红细胞压积(hematocrit,Hct)、红细胞聚集指数(EAI)、血沉方程K值(ESRK)、红细胞刚性指数(TK)较单纯缺血/再灌注损伤组明显下降(P＜0.01),而红细胞变形指数(EDI)增加(P＜0.01,表2)。

2.3 血清中 P-选择素和ICAM-1的水平

肝素组P-选择素和ICAM-1的含量均明显低于单纯缺血/再灌注组(P＜0.01,表3)。

Tab.1 Changes of mesenteric microcirculation in different groups(±s,n=10)

Tab.1 Changes of mesenteric microcirculation in different groups(±s,n=10)

AD:Microvascular arteriole diameter;VD:Microvascular venule diameter;AFV:Arteriole flow velocity;VFV:Venule flow velocity;H:Heparin;I/R:Ischemia/reperfusion**P＜0.01 vs H group

Group AD(μ m) VD(μ m) AFV(μ m/s) VFV(μ m/s)H 14.85±0.48 18.80±1.01 1516.10±83.33** 1320.40±83.41**I/R 16.27±0.63** 21.07±1.21** 992.15±84.95** 784.36±84.45**

Tab.2 Changes of mesenteric hemorheology in different groups(±s,n=10)

Tab.2 Changes of mesenteric hemorheology in different groups(±s,n=10)

η p:Plasma viscosity;L η re:Low shear reduction viscosity;Hη re:High shear reduction viscosity;Hct:Hematocrit;EAI:Erythrocyte aggregation index;ESR K:Erythrocyte sedimentation rate K;TK:Erythrocyte rigidity index;EDI:Erythrocyte deformability index**P＜0.01 vs H group

G η p(mPa.s) Lη re(mPa.s)Hη re(mPa.s) Hct(L/L) EAI ESRK TK EDI H 1.23±0.19 42.62±0.614.70±0.18 0.45±0.03 5.61±0.22 3.92±0.14 3.75±0.14 0.68±0.01 I/R 1.35±0.03**44.46±0.44**6.13±0.12**0.58±0.02**6.13±0.14**4.50±0.42**4.75±0.31**0.60±0.01**

Tab.3 Changes of plasma P-selectin and ICAM-1 in different groups(pg/ml,±s,n=10)

Tab.3 Changes of plasma P-selectin and ICAM-1 in different groups(pg/ml,±s,n=10)

**P＜0.01 vs H group

Group P-selectin ICAM-1 H 2031.51±122.63 1077.89±47.36 I/R 1876.30±119.95** 1362.26±94.22**

3 讨论

缺血组织再灌注后引发一系列复杂的反应使组织细胞损伤持续存在并加重,甚至引发多器官功能衰竭,其机制尚未完全阐明,除了已经公认的活性氧、细胞内钙超载、白细胞爆发以外,近年研究也表明IRI时微循环功能的恶化是导致全身多器官功能损伤的基础之一,而微循环功能的恶化又与血管内皮细胞的损伤[3]、白细胞的介导损伤[4]、炎症介质和粘附因子增多及血液流变学的改变密切相关[5]。肠系膜微循环是全身微循环变化的一个窗口,因其便于观测而成为了解全身微循环变化的一种手段。LI/R时肠系膜微循环有特征性改变,主要表现为LI/R初期肠系膜微动、静脉管径减小,随着缺血肢体再灌注时间的延长,逐渐出现血管扩张和血流速度减慢,同时白细胞边集的现象越来越明显,并逐渐发生白细胞滚动和贴壁,甚至可以见到血小板栓子的形成,LI/R后期肠系膜微动、静脉管腔严重扩张,血流速度减慢,微血管中大量白细胞贴壁、粘附,白微栓形成增多,局部区域可见微血管破裂、血细胞溢出。当再灌注200 min后,部分毛细血管闭塞、血流停滞,管周出血现象加重[5]。

P-选择素与ICAM-1是血管黏附分子家族中的重要成员,在LI/R过程中可以介导白细胞黏附、浸润、渗出和释放炎症介质,从而导致微循环功能的恶化,进而引起器官功能的损伤。

肝素是一种临床常用抗凝药物,主要通过与抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)结合,而增强后者对活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用。其后果涉及阻止血小板凝集和破坏,妨碍凝血激活酶的形成;阻止凝血酶原变为凝血酶;抑制凝血酶,从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。有研究报导肝素可以通过保护微血管内皮细胞而改善内毒素血症大鼠微循环的功能而减轻器官功能的损伤[3];也有研究显示肝素还可以通过降低血浆中D-二聚体水平改善缺血/再灌注损伤胰腺的微循环功能。

本实验观察到肝素在肢体缺血/再灌注损伤时可以明显降低血清P-选择素和ICAM-1的水平,改善血液流变性状,使肠系膜微循环功能改善。但是早期应用肝素是否可以减轻全身器官的损伤,提高LI/R后的生存率尚需进一步的观察。

[1]杨秀红,张连元,孙树勋,等.一氧化氮在大鼠肢体缺血再灌注后肺损伤中的作用[J].生理学报,2002,54(3):234-238.

[2]门秀丽,张连元,宋立川,等.肢体缺血再灌注后红细胞变形能力的改变及其缺血预适应的保护作用[J].中国病理生理杂志,2001,17(12):1178-1211.

[3]Iba T,Takayama T.Enoxaparin attenuates endothelial damage with less bleeding compared with unfractionated heparin in endotoxemic rats[J].Shock,2009,32(5):530-534.

[4]Qi F,Adair A,Ferenbach D.Depletion of cells of monocyte lineage prevents loss of renal microvasculature in murine kidney transplantation[J].Transplantation,2008,86(9):1267-1274.

[5]赵 霞,张 娜,王银环,等.肢体缺血再灌注损伤对大鼠肠系膜微循环和血液流变性的变化及意义[J].中国微循环,2008,12(4):215-218.