API 20C和科玛嘉显色培养鉴定酵母菌的比较

金 云，江 情，李智华，罗云鹏，陶 丽，占 萍

(江西省皮肤病专科医院，江西 南昌 330001)

API 20C AUX系统和科玛嘉酵母菌显色培养基为临床常用的酵母菌鉴定方法，为比较这两种方法的优缺点，并了解我院门诊患者皮肤粘膜的酵母菌菌种构成，我们对我院2008年6月至2009年5月分离的138株酵母菌分别用API 20C AUX生化系统和科玛嘉酵母菌显色培养基两种方法进行鉴定，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源 共收集酵母菌138株，分离自我院门诊患者的皮屑、甲屑、粘膜 (口腔和生殖器部位)。

1.2 菌株活化、增殖和鉴定 将初代菌挑取单菌落在SDA平皿上划线分离纯化，培养24～48h新鲜的菌落分别用API 20 C AUX生化鉴定系统 (法国梅里埃生物公司生产)和科玛嘉酵母菌显色培养基(干粉购自郑州博赛公司，原制造商为法国CHROagar公司)进行鉴定。

1.2.1 API 20 C AUX鉴定步骤 准备一个培养盒，倒入约5ml蒸馏水于盘的蜂窝小凹中，造成一湿室。记录菌株编号于盘的长边部分。从包装中取出试验条，放入培养盒中。取一安瓿0.85%NaCl培养基(2ml)，挑取待鉴定菌落制成2麦氏浓度的均一菌悬液，再取100μl转入API 20C培养基安瓿瓶内，混匀。将API 20C培养基中菌悬液注入API C板条小杯内。沿杯壁小心注入，不要产生气泡，不要过满(表面平或稍凸)。盖上盖子，27℃孵育48～72h判读结果。采用apiwebTM软件获取鉴定结果。

1.2.2 科玛嘉酵母菌显色培养基鉴定步骤 所购干粉按47.7g/L比例用无菌蒸馏水溶解、加热(不超过100℃)、充分混匀后，倾入已灭菌带盖的6cm培养皿中，每个平皿约10ml，冷却凝固后放4℃冰箱内备用。使用前取出培养基恢复至室温，将待鉴定菌株划线或涂布接种，25～30℃培养48h，依据颜色变化判断结果。绿色、翠绿色为白假丝酵母菌，蓝灰色、铁蓝色为热带假丝酵母菌，粉红色(模糊有微毛菌落较大)为克柔假丝酵母菌，紫色为光滑假丝酵母菌。白色为其他酵母菌。

2 研究结果

138株菌株，来自男性81株，女性57株，年龄6月～84岁，来自皮屑109株 (79.0%)，甲屑5株(3.6%)，粘膜 23 株(16.7%)，大便 1 株(0.7%)。

通过科玛嘉培养基，鉴定出白假丝酵母菌76株，热带假丝酵母菌2株，其他菌株难以鉴定，未发现克柔假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌。

通过API20AUX生化鉴定系统。鉴定出白假丝酵母菌76株和光滑假丝酵母菌2株，与科马嘉培养基鉴定结果完全符合。另外，该方法还鉴定近平滑假丝酵母菌32株 (23.2%)，高里假丝酵母菌10株(7.2%)，无名假丝酵母菌6株(4.3%)，阿萨丝孢酵母菌4株(2.9%)，罗伦隐球菌3株(2.2%)，土生隐球菌2株(1.4%)、涎沫假丝酵母菌1株(0.7%)，粘红假丝酵母菌1株(0.7%)，小红假丝酵母菌1株(0.7%)。详见表1。

表1 两种鉴定方法的比较

图1 近平滑假丝酵母菌在科玛嘉上的形态：左边为皱褶菌落，右边为光滑菌落

在科马嘉显色培养基上，笔者发现一些其他类型的念珠菌也显示颜色，如近平滑假丝酵母菌为粉红色，颜色类似与克柔假丝酵母菌，但是菌落较小，光滑或皱褶，约1～2mm左右，周围无微毛(见图1)，而且有部分菌株48h内不显示颜色，72h后才转变为粉红色，而克柔假丝酵母菌菌落较大，约4mm，周围有微毛[1]；无名假丝酵母菌为浅蓝色，类似于热带假丝酵母菌的颜色，但是颜色较淡，为淡蓝色，无假菌丝，而热带假丝酵母菌菌落光滑、湿润，颜色更深，生长成熟的菌株为紫蓝色，菌丝丰富。(见图2)。根据这些特征，大致可以区分，但准确鉴定尚需API 20C确认。

图2 热带假丝酵母菌和无名假丝酵母菌的不同形态：左边为无名假丝酵母菌，为淡蓝色，右边为热带假丝酵母菌，显紫蓝色。

在API鉴定系统中，需要注意的是，需要取纯化24～48h的单菌落进行鉴定，否则无法得出正确结果。在判读结果时，有时候对照杯也会产生一定浊度，所以试验杯需要与对照杯相比较，比对照杯更浊的才为阳性反应。

3 讨论

酵母菌为人类皮肤粘膜常驻菌群，大部分为条件致病菌，一定条件下可导致局部和系统感染，其中最常见为念珠菌和马拉色菌属，因为马拉色菌为嗜脂性，普通SDA培养基上不生长，容易区分，其他酵母则绝大部分为白色酵母样菌落，难以判断菌种。

近些年来，由于广谱抗生素和免疫抑制剂的使用，以及HIV和糖尿病等免疫受损人群增多，假丝酵母菌的发病率和致死率日益增高，其他非假丝酵母菌性酵母及酵母样真菌引起皮肤黏膜感染的报道也屡见不鲜[2-4]。另外，据报道，在假丝酵母菌中，白假丝酵母菌所占的比重逐渐下降，近平滑、热带、光滑和克柔的感染率在较快上升，其中部分菌种对氟康唑不敏感或天然耐药[5-6]。因此，临床上准确、快速鉴定菌种，指导医生选择敏感抗真菌药物有着重要意义。

酵母菌鉴定常通过形态学、生化反应、血清学试验等综合判断，但是操作繁琐，耗时长，存在误差，且不能判断混合感染，因此局限了其应用。目前临床常用的酵母菌鉴定方法为科玛嘉酵母菌显色培养基和API 20C AUX生化鉴定系统，前者成本低，操作和判读简单，结果较为准确，可用作快速和初步鉴定，但是能鉴定的菌种少，仅包括白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌和热带假丝酵母菌，其他菌种无法鉴定，如本研究中比例较高的近平滑假丝酵母菌无法鉴定；另外，根据笔者经验，光滑和克柔假丝酵母菌在培养基上常颜色类似，难以判断。法国梅里埃公司开发的API 20C AUX酵母菌生化系统为一种很好的鉴定酵母菌的方法，可以准确鉴定多种酵母菌，可用作金标准，该方法的不足之处是试剂和软件成本较高，操作较为繁琐少。在本研究中，临床138株酵母菌，以上两种方法均能鉴定的菌种符合率100%，说明这两种方法有较好的一致性，但后者鉴定的菌种远多于前者，结果更可信。因此，前者适合临床快速、简单鉴定常见假丝酵母菌，而后者适用范围更广，可用于鉴定多种酵母菌。

查阅文献，国内关于假丝酵母菌菌种分析的报道多为深部假丝酵母菌病，针对皮肤黏膜部位假丝酵母菌定植和致病菌种的研究缺乏，仅熊亚等在分析重庆地区浅部真菌病病原菌时对分离的小部分假丝酵母菌进行鉴定，发现白假丝酵母菌最多，克柔假丝酵母菌次之[7]。在我们的研究中，近平滑假丝酵母菌为第二优势菌种。另外，在23份黏膜部位标本中，22份为白假丝酵母菌，仅1份为近平滑假丝酵母菌。而汕头地区报道的1164份生殖器标本中，第二位优势菌为近平滑假丝酵母菌(7.46%)，光滑假丝酵母菌次之(3.39%)[8]。而重庆地区报道的118例口腔标本中，热带假丝酵母菌占第二位(12.7%)，其次为高里假丝酵母菌 (5.1%)[9]。这些差异可能与不同地区、标本来源、样本量以及鉴定方法有关。

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