用Sevag法分离闽西巴戟天粗多糖中蛋白质的研究

孙德辉，陈忠良

（福建省中心检验所，福建 福州 350002）

巴戟天（Morinda Officinalis How）属于茜草科（Rubiaceae）植物，是多年生藤本植物的肉质根，分布于福建、广东、广西、海南等热带和亚热带地区，是我国南方著名的滋补药材。它具有补肾阳、强筋骨、抗衰老、抗肿瘤及增强免疫力等功效。[1]研究结果表明，其含有的多种营养成份如糖类、蛋白质、黄酮类、酚类、以及其他人体所需的有机物质，[2]在医药、食品、保健品方面均有良好的开发前景。近年来，随着人们对多糖生物学功能的深入认识，巴戟天多糖成份所具有明显的免疫增强作用正成为人们关注的焦点之一。[3]目前已开发的巴戟天产品有巴戟天酒、巴戟滋补膏等保健食品，受到食疗家们的欢迎。从巴戟天中提取多糖的方法主要是采用热水提取及乙醇沉淀，过滤干燥后得到的粗多糖中含有部分的蛋白质、色素等其他成份，这些杂质成份的存在不利于对巴戟天多糖的理化性质、多糖换算因子等项目测试的开展，所以必须要将这些干扰物质分离掉。Sevag法[4]可作为分离蛋白质的有效手段之一，[5]本实验通过用Sevag法对闽西巴戟天粗多糖中蛋白质的分离处理试验，探讨Sevag试剂的使用剂量和合适的分离次数，以期能为巴戟天多糖的后续测试工作提供参考。

一、材料与方法

（一）材料、试剂与仪器

巴戟天为闽西种植园提供的干品，经切块粉碎过筛。正丁醇（A.R 汕头市西陇化工厂）蒽酮、浓硫酸、95%乙醇、乙醚均为（A.R国药集团化学试剂有限公司），水均为去离水。

Lambda 40 紫外一可见分光光度计（美国PE公司）

BS224S 电子分析天平（德国赛多利斯）

2400KT FOSS定氮仪（瑞典FOSS）

二、方法

（一）巴戟天粗多糖的制备

将巴戟天粉碎样经乙醚回流脱脂后，于10倍沸水浴中加热回流2h，冷却后过滤，于滤液中加入5倍体积的95%乙醇，低温静置过夜，收集沉淀物，冷冻干燥得粗多糖样品。

（二）Sevag试剂的配制

分别将三氯甲烷和正丁醇以4:1的体积比充分混合均匀，并密闭保存于避光处。

（三）葡萄糖标准溶液的配制：取D一无水葡萄糖（于105℃烘干）按1.0mg/ml浓度配制。

（四）蒽酮试剂：称取0.1g蒽酮于100ml容量瓶中，加入浓硫酸溶解，定容到刻度线（于使当天临时配制）

（五）标准曲线制备：分别吸取浓度为1.0mg/ml的葡萄糖标准溶液0.00ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml于50ml容量瓶中，加水定容至刻度，再精确吸取上述标准液各2.0ml置于25ml比色管中，于冰水浴中加入蒽酮试剂5.0ml，摇匀后于水浴中加热煮30min，用自来水冷却至室温后，于波长625nm处测定吸光值，再作浓度和吸光度的标准曲线，得回归线性方程式。

（六）Sevag试剂分离粗多糖中蛋白质的试验[6]，[7]

1、供试样品的制备：准确称取巴戟天粗多糖样品0.250g，用水溶解后定容于250ml容量瓶中，摇匀。

2、分别取上述试液4份各10ml于100ml具塞比色管中，按样品溶液：Sevag试剂体积比例为1:1、1:2、1:3、1:4分别混合，盖好塞子后充分振摇20min，于分液漏斗中静置分层，保留水相层，弃去乳白色的有机层。

3、在水相层中再分别加入上述比例的Sevag试剂3次，共计处理4次，重复前面的操作步骤。

4、分别吸取处理后的水相层溶液2.0ml，用蒽酮一硫酸法按2.5步骤测多糖含量，另吸取5.0ml水溶液用浓硫酸消化后于凯氏定氮仪测总蛋白质含量。

三、结果和讨论

通过用不同比例样品液与Sevag试剂的混合处理后，结果见表1。

表1 不同比例分离的结果比较

从表1结果可知，在样品液和Sevag试剂的体积比为1:1时，蛋白质的分离率最高，但同时带来的问题是最高的多糖损失率，比较结果分析，在3:1和4:1比例时，蛋白质去除率和多糖损失率趋向相近，比较3:1与4:1的结果，蛋白的去除率增加5.2%，多糖损失率仅上升0.3%，所以选择以3:1的体积比进行分离次数试验，结果见表2。

表2 分离次数的结果比较

巴戟天用水提醇沉办法得到的粗多糖，夹杂有会干扰多糖精确测试的蛋白质成份，它能够在分光法测试过程中与多糖相同的波长范围内产生叠加的吸光度，造成测试结果偏高，通过使用Sevag法脱除蛋白质，为巴戟天多糖的后续测试研究工作排除干扰。经过试验结果表明，按样品液与Sevag试剂体积比例为3:1的处理结果能取得较为满意的结果。理论上对蛋白质分离处理次数越多次，蛋白质去除率会越高，但不可忽视的是造成多糖的损失率的上升，而且还会增加试剂的消耗量。从表2的结果分析，用Sevag试剂处理3～4次后，巴戟天多糖中蛋白质的去除率已达80%，而多糖损失率在20%以内，这项结果显示，后期在巴戟天多糖测试的工作中，应该要考虑到多糖损失的因素，以保证足够的后续试验对精制多糖的需要量。Sevag法分离巴戟天多糖中的蛋白方法所具有操作简便、分离效果良好及不需要高昂的成本投入等特点，仍不失为分离蛋白质行之有效的一种方法。对于多糖损失率的问题，我们考虑到可能是在用Sevag试剂处理时，有少量的多糖与蛋白质结合成蛋白聚糖或糖蛋白沉淀到有机层而损失掉，而如何采取措施减少多糖的损失率将是在我们今后的工作中要加以研究的问题。

[1]姚辉，赵晟.名贵南药巴戟天[J].植物杂志.2002（1）21-23

[2]周法兴.巴戟天化学成分的研究[J].中药通报.1986 11（9）:43

[3]陈小娟，李爱华，陈再智.巴戟多糖免疫药理研究（J）.实用医学杂志，1995.（9）：348-349

[4]Staud A M. Methods in Carbohydrate Chemistry V General Polysaccharides. New York: Academic Press,1965

[5]蒋新宇.多糖（M）.见：陈晓青，蒋新宇，刘佳佳 主编 中草药成分分离技术与方法.北京：化学工业出版社，2006：123-7.

[6]齐慧玲，魏绍云等.Sevag法去除白及多糖中蛋白的研究（J）.天津化工,2000（3）20-21.

[7]夏泉，刘刚，葛朝亮，许杜鹃.Sevag法去除黄芪粗多糖中蛋白质成分的研究（J）.安徽医药,2007.12；11（12）1069-1070.