微小隐孢子虫抗原CTL细胞表位预测及多表位基因的原核表达

李 艳,陈兆国,聂 奎,米荣升

(1.西南大学动物科技学院,重庆 400714;2.中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室 中国农业科学院动物源性食品安全研究中心,上海 200241)

隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是一种世界性分布的人兽共患病,在免疫功能正常的机体中,可引起自限性腹泻[1],在免疫功能缺陷患者如艾滋病(AIDS)病人中,可导致严重甚至威胁生命的疾病[2]。该病已被列为世界最常见的 6种腹泻病之一,并被 WHO和美国疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)列入新发传染病。目前对该病尚无特效药物,绝大多数抗生素、抗寄生虫药均无效,因此隐孢子虫病的免疫预防研究就愈发显得重要。

随着分子生物学技术在寄生虫学领域的广泛应用,隐孢子虫疫苗候选分子的鉴定、基因克隆及表达等研究取得了较快发展,已报告了约 30种有希望的疫苗候选分子。目前的重点主要集中在几种与入侵机体紧密相关的虫体表面蛋白[3-4],但单一疫苗候选分子的保护效果并不理想[5-6]。其原因可能是隐孢子虫基因组巨大,生活史复杂,抗原种类繁多,抗原的免疫机制不清,导致单一抗原、单一表位保护效果不够理想。近年来国际寄生虫学界兴起了利用抗原表位预测工具,开展抗原表位预测,构建多表位疫苗(multi-epitope vaccine)的热潮,而且也取得了阶段性成果,尤其在抗疟疾多表位疫苗研制领域,已设计合成了多个基因工程疫苗和合成肽疫苗,取得了较好的免疫保护效果,其中不少已进入Ⅱ期甚至Ⅲ期临床试验[7-10],但是目前在隐孢子虫尚无这方面的报道。

CD8+细胞毒性 T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)在抗细胞内病原的保护性反应中发挥重要作用。隐孢子虫的免疫机制目前尚不清楚,普遍认为与机体细胞免疫功能状态有关,有学者认为 CD8+T细胞可能在牛抗微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)感染中起重要作用[3],因此对隐孢子虫 CTL表位进行研究具有十分重要的意义。本研究利用生物信息学软件,对微小隐孢子虫候选疫苗抗原与宿主 MHCⅠ类分子 H2-Kd、H2-Ld和 H2-Dd结合的表位分别进行预测,筛选出 10个得分较高的表位序列进行串联,将该多表位基因重组入 pET-28a(+)进行原核表达,并通过免疫印迹实验对融合蛋白的免疫原性进行初步验证,旨在为隐孢子虫多抗原多表位疫苗的研制打下基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料T4DNA连接酶、限制性内切酶BamH I和 HindⅢ、pMD-18T载体购自 TaKaRa公司;DNA胶回收试剂盒购自 AxyPrep;IPTG购自上海浩然生物技术有限公司;HRP标记的山羊抗兔 IgG多克隆抗体、DNA Marker、蛋白质分子质量标准购自 TIANGEN公司;大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3)和 pET-28a(+)由中国农业科学院上海兽医研究所保存;鼠抗微小隐孢子虫血清由实验室自制。

1.2 微小隐孢子虫CTL细胞表位预测 从文献中查找目前报道的潜在的微小隐孢子虫候选疫苗抗原,记录其 GeneBank登录号,从 NCBI中下载相关蛋白序列。运用表位预测服务器SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/home.htm)、ProPred-Ⅰ(http://www.imtech.res.in/raghava/propred1/)和NetMHC 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/),分别对微小隐孢子虫各个抗原的可能产生 9个氨基酸残基的 H2-d(包括 H2-Kd、H2-Ld和 H2-Dd)限制性 CTL表位进行预测。具体方法为:预测 H2-Kd、H 2-Ld限制性表位时,将抗原氨基酸序列分别输入服务器,保存 SYFPEITHI预测分值大于 20的 9肽;同时保存 ProPred-Ⅰ返回结果的前 15位;寻找二者的重复序列。按照文献[11]报道的方法,计算两者所含 MHCⅠ类分子结合 9肽的得分并排序,选取得分明显大于其他肽段的序列。同时结合 NetMHC 3.0预测结果,进行综合分析。预测 H2-Dd限制性表位时,保存 ProPred-Ⅰ返回结果的前 15位,结合 NetMHC 3.0预测结果,进行综合分析。

1.3 微小隐孢子虫CTL多表位基因的设计和合成 从目前研究较多的微小隐孢子虫候选疫苗抗原 CP15、gp15/45/60、GP900、cpa135、TRAP-C1、CP15/60中选取 10段预测分值较高的 CTL表位串联在一起,表位之间用柔性氨基酸 GGGGS或 GPGPG链接;5′端依次加上保护性碱基CCAAT、酶切位点 BamH I、kozac序列 、起始密码子(ATG)、防错位保护碱基 GCT;3′端加上保护性碱基 CCAAT,酶切位点 HindⅢ、终止密码子TTA,将该基因命名为 CpCTL10。序列由上海英俊生物技术有限公司合成并连接到 pMD-18T载体上,命名为 pMD-CpCTL10。

1.4 微小隐孢子虫多表位基因的克隆和表达

1.4.1 微小隐孢子虫多表位基因原核表达质粒的构建及鉴定 取 pET28a(+)质粒和 pMDCpCTL10质粒,分别用 BamH I和 HindⅢ双酶切,回收载体和目的基因片段,用 T4DNA连接酶连接。连接产物转入大肠杆菌 DH 5α感受态细胞,筛选阳性菌落。碱裂解法提取质粒,经酶切及测序鉴定正确后转化至大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞。

1.4.2 重组质粒的诱导表达 将鉴定正确的BL21(DE3)转化菌培养至 D600nm达 0.5左右时,以终浓度为 1.0 mmol/L的 IPTG诱导 7 h,期间每隔 1 h取样。将表达产物进行 15%SDSPAGE电泳,观察蛋白表达。取 IPTG诱导 7 h的表达菌,液氮冻融 3次并进行超声波裂解,收集上清液,沉淀加 8 mol/L尿素溶解,离心后分别收集尿素上清和沉淀,分析重组蛋白的存在形式。

1.4.3 重组蛋白的纯化 诱导表达的菌体用1×结合缓冲液(0.5 mol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L咪唑,pH7.9)充分悬浮,冻融超声裂解后离心收集包涵体,用含尿素的结合缓冲液重悬,离心后取上清。经 Ni-NTA His Bind Resin层析柱进行分步洗脱并收集含目的蛋白的洗脱液,对纯化的蛋白进行 SDS-PAGE鉴定。

1.5 重组蛋白的 Western blot分析重组蛋白经 SDS-PAGE电泳后,电转移至硝酸纤维素(NC)膜上进行免疫印迹检测。将 NC膜浸在含 50 g/L脱脂奶粉的磷酸缓冲液 PBST中,室温封闭 2 h,用 PBST洗涤后,将 NC膜与 1∶200稀释的鼠抗微小隐孢子虫血清温育 1 h,洗涤后再用稀释度为1∶1 000的 HRP标记的羊抗鼠 IgG温育 1 h,用二氨基联苯胺(DAB)溶液显色。

2 结果

2.1 微小隐孢子虫CTL疫苗候选抗原表位预测 从文献报道中收集到 31个隐孢子虫疫苗候选抗原,对其进行抗原表位预测,共获得 H 2-d型CTL表位 226个。其中 H2-Kd型 CTL表位 136个、H2-Ld型 CTL表位 69个、H2-Dd型 CTL表位21个。

2.2 微小隐孢子虫CTL多表位基因的设计和合成 从 6个研究较多的疫苗候选抗原中选取10段预测分值较高的 CTL表位,设计合成了 1条编码 137个氨基酸的多表位基因,加上保护性碱基、酶切位点、kozac序列、起始密码子、防错位保护碱基及终止密码子,全长 442 bp,命名为CpCTL10。

2.3 重组质粒的诱导表达重组表达质粒 pET-28a-CpCTL10经 HindⅢ和 BamHⅠ双酶切鉴定正确(图 1)后转化 BL21(DE3)菌,经 IPTG诱导7 h后表达量达到最高(图 2),SDS-PAGE分析蛋白的分子质量与预计的18 ku相近。BandScan软件分析显示,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55.3%,主要为包涵体表达。表达产物经 His亲和层析树脂纯化,获得了较纯的目的蛋白(图 3)。BandScan软件分析显示,融合蛋白约占纯化后总蛋白的 75.1%。

图 1 重组表达质粒 pET-28a(+)-CpCTL10的双酶切鉴定Fig.1 Identification of pET-28 a(+)-CpCTL10 digested by restriction enzyme

图 2 重组蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳分析Fig.2 SDS-PAGE resu lts of the different strain exp ression products of recombinant

图 3 纯化的表达产物SDS-PAGE电泳结果Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis resu lt of the purified expressed recombinant protein

2.4 重组蛋白的 Western blot分析结果显示,重组蛋白 CpCTL10(recombinant CpCTL10,rCpCTL10)蛋白与鼠抗微小隐孢子虫血清出现特异性反应(图 4)。

3 讨论

在以往的隐孢子虫疫苗研究中,人们通常利用单一的一个隐孢子虫抗原基因或其表达产物来研制和发展疫苗,但是,此类疫苗并未获得满意的免疫保护效果。究其原因可能是因为隐孢子虫生活史复杂,包含多个发展阶段;抗原种类繁多,不同阶段表达的蛋白不同,单一的抗原无法彻底阻断病原在宿主体内的生活周期。使用多抗原疫苗时,由于载体容量有限,而且大分子蛋白可能会造成动物免疫病理反应,所以在单一载体中加入多个抗原存在很大的局限性。而多表位疫苗突破了这一瓶颈,能同时携带多个目标抗原的相关表位,以期达到协同作用,提高免疫保护效果,因此也称鸡尾酒式疫苗。它是近年来疫苗研究的新方向,已广泛应用于抗病毒性疾病、细菌感染、癌症和寄生虫感染等方面的研究[12]。贾雷立等[13]以 H 3、H 9亚型流感的 HA抗原表位及流感病毒的其他主要抗原 NP、NA、M表位基因为基础,构建重组质粒,在 Hela细胞中表达出流感病毒多表位抗原蛋白,具有较好的抗原性;Tumengargal等[14]将筛选出的皮肤淋巴瘤 T表位与 Th表位一起接种患者,恶性细胞几乎全部受到抑制并在血液中检测到具有肿瘤杀伤活性的 CTL细胞;Patarroyo等[7]研制的复合多价 45肽疫苗 SPf66是第一个成功的抗疟疾(malaria)疫苗;Amon等[15]用随机肽库技术筛选法鉴定了 3个血吸虫模拟 B表位,偶联 BSA接种小鼠,减虫率与接种灭活虫体的阳性组基本一致。在隐孢子虫病研究方面,国内外尚无类似多表位疫苗研制的报道。基于上述原因,本研究尝试从多个免疫效果较好的微小隐孢子虫抗原中选取 T细胞表位,构建高效多表位复合疫苗。

图 4 表达产物的 W estern b lot分析Fig.4 W estern blot ana lysis of the exp ressed p roducts

蛋白质抗原表位选择是表位疫苗研制的重要前提。其中 T细胞抗原表位获取方式主要有 4种:化学与生物学筛选法、肽探针扫描技术筛选法、随机肽库技术筛选法、生物信息学方法预测细胞表位。随着计算机科学和生物信息学的发展,基因组大规模测序工作的开展,表位数据种类和数量的积累,表位的预测技术已日趋完善。与传统获取表位方法相比,表位预测能极大地减少实验工作量,节约研究经费,加快研究进展。CTL表位预测方法主要有两种,一种是基于抗原肽与 MHCⅠ类分子结合特性的预测方法,包括结合基序法、矩阵法、人工神经网络、隐马尔可夫算法等;另一种是针对抗原加工处理过程的预测方法。其中,抗原肽与 MHCⅠ类分子结合特性的预测技术比较成熟,常用的工具有 SYFPEITHI、BIMAS、Pridict、MHCPred等 。 SYFPEITHⅠ是由Rammensee等开发的,是根据 MHC配体和结合肽模体方案设计的算法,其中包含了各种人、小鼠及大鼠的 MHCⅠ类分子表位的预测[16]。ProPredⅠ是由 Singh等开发,是基于量化矩阵的方法来计算预测肽结合的积分值,该服务器可进行 47个 MHCⅠ等位基因分子结合肽的预测[17]。近年来,这两种算法都成功地用于大范围抗原CTL表位的鉴定[18]。NetMHC 3.0是由 Buus等开发,利用人工神经网络算法对 CTL表位进行预测[19]。由于数据库和算法的差异,会导致不同服务器预测的结果存在不同。Schonbach等[20]研究发现,将多个服务器的预测结果结合起来,可以提高表位预测的准确性。本文采用 ProPredⅠ、SYFPEITHⅠ、NetMHC 3.0等 3个算法和数据库各异的服务器对微小隐孢子虫的 H-2d CTL表位进行综合预测,选择几个服务器预测结果均比较理想的表位作为候选肽段,提高了筛选到有效表位肽的几率。由于大部分能与 MHC-Ⅰ类分子结合的多肽都有严格的长度,一般为 8～10个氨基酸残基组成,其中 9肽最为常见,因此本研究只对可能产生 9个氨基酸残基组成的 CTL表位进行预测。H2-Dd限制性 CTL表位只有 ProPred-Ⅰ和 NetMHC 3.0 2个服务器可用,因此本研究只保存这 2个服务器返回结果的前 15位来筛选重复 9肽序列。

在表位串联上,本研究采用直接串联表位的方法构建多表位疫苗,即直接将多个表位首尾相连形成聚合表位,将编码该复合表位的 DNA序列重组入表达载体,来表达多个保护性抗原表位。表位直接串联是最直接的多表位疫苗设计方法,可以提高表位的免疫原性。年丛华等[21]将刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)主要抗原 SAG1、GRA1、ROP2和 GRA4的表位串联起来研制多表位核酸疫苗,发现该疫苗可引起重要的体液免疫和细胞免疫反应,并能延长致死剂量弓形虫 RH株速殖子感染小鼠的存活时间。在各个表位之间,本实验根据文献报道在 10个表位肽间加入接头序列 GGGGS[22]或 GPGPG[23],使各个抗原表位在空间上互相独立,防止多肽分子由于空间结构发生变化而阻碍其和 MHC分子的结合,同时适当提高免疫肽分子量,以增强蛋白的免疫原性。

综上所述,本研究利用生物信息学软件预测,在综合考虑了候选疫苗抗原种类、表位组合、表位间连接方式等多方面因素后,人工合成了一个包含 10个 CTL表位的多表位基因 CpCTL10,并成功地进行了原核表达,表达的重组蛋白经初步分析显示具有良好的抗原性,为下一步构建抗隐孢子虫的多抗原多表位疫苗打下了基础。

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