大肠肿瘤p53和ki-ras基因协同突变的研究

侯睿哲,侯睿智,彭云香,侯治富*

(1.吉林大学白求恩医学院,吉林 长春 130021;2.吉林大学中日联谊医院,吉林 长春 130033)

大肠肿瘤p53和ki-ras基因协同突变的研究

侯睿哲1,侯睿智2,彭云香2,侯治富2*

(1.吉林大学白求恩医学院,吉林 长春 130021;2.吉林大学中日联谊医院,吉林 长春 130033)

目的探讨大肠肿瘤p53和ki-ras基因协同突变的临床意义。方法采用免疫组化和PCR-SSCP方法,检测58例大肠肿瘤患者的良性病变、良性病变转为恶变、原发腺癌组织的p53基因、ki-ras基因的表达和突变情况。结果良性病变组与恶变组间的p53基因和Ki-ras基因的表达有显著差异,良性病变组与原发腺癌组的Ki-ras基因表达差异显著;良性病变组的p53基因与Ki-ras基因的表达呈负相关,而恶变组和原发腺癌组呈正相关。p53基因和ki-ras基因两种基因突变率无显著差异,而协同突变与淋巴结转移密切相关,相关系数r=0.335,P=0.017,P＜0.05。结论p53和ki-ras基因协同突变可以促进了大肠癌的发展。监测p53基因和Ki-ras基因的协同表达和突变,有助于大肠肿瘤的早期诊断和预后评价。

p53基因;ki-ras基因;大肠肿瘤;协同突变

据世界卫生组织报告,恶性肿瘤每年全球新发病例 1000多万,死亡700多万,占总死亡人数的12%,在多数发达国家这一数字可达25% 。预期到2020年,在发展中国家,将增长73%。结肠、直肠癌在我国仍然高居恶性肿瘤发病的前十位。尽管p 53基因和ki-ras基因与大肠肿瘤的研究提出较早,也较多,我们的前期工作中也做过诸多探讨。2000年以来,《Nature》等杂志相继报道了对p53基因和kiras基因新的认识。Levine等学者提出了p53基因网络的概念[1],还有学者发现了 p53抑癌新机制等[2,3],并有学者提出了ki-ras基因可以作为大肠肿瘤早期筛查的指标。为了进一步阐明p 53基因和ki-ras基因与大肠肿瘤的关系,本文对58例大肠肿瘤患者的良性病变、癌组织,采用免疫组化、聚合酶链反应-单链构像多态性(PCR-SSCP)分析法,同时检测p53和ki-ras基因表达及其突变情况,并对两者的协同突变进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 标本来源与分组 58例病人均为吉林大学白求恩第三医院住院患者,男35例,女23例。年龄28-82岁。良性病变组5例,由良性病变转为恶变组9例,原发肠癌组44例。术后病理有淋巴结转移者20例,无转移者38例。全部标本均经病理诊断证实。取材前均未接受放、化疗。

1.2 主要试剂 限制性内切酶、DNA聚合酶等工具酶购自Promega公司;p53和ki-ras免疫组化检测试剂购于博士德生物工程有限公司。

1.3 引物设计与合成 依据GeneBank数据库提供的p53和ki-ras基因序列,采用引物设计软件,按引物设计原则设计。并在上、下游引物分别引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点。由上海生工生物工程公司合成(见表.1)。

Tab.1 Primer sequence of exons of p53 and Ki-ras

1.4 实验方法

1.4.1 切片制备 石蜡包埋标本进行连续切片,厚度4 μ m,常规 HE 染色 。

1.4.2 免疫组化染色 以正常大肠粘膜组织为阳性对照,以PBS为阴性对照。切片常规脱蜡、水化,微波修复抗原,按试剂盒说明染色,经DAB显色,苏木精复染,干燥、透明、封片,显微镜下计数结果。

1.4.3 结果判定 p53表达于细胞核内,ki-ras表达于细胞质内。在核内或细胞质内有棕黄色显色者定为阳性细胞。观察切片中10个具有代表性的高倍视野,阳性细胞数小于10%定为(-),大于10%为(+)。

1.5 PCR-SSCP方法 酚氯仿经典法制备样本DNA,按引物设计列表进行PCR-SSCP分析p53基因5-8外显子和Ki-ras基因第一外显子突变。若出现额外条带或出现条带迁移率异常即为阳性。

1.6 统计学方法 运用SPSS 13.0统计软件,采用t检验、相关分析和 χ2检验分析实验结果。

2 结果

2.1 大肠肿瘤p53基因和ki-ras基因协同表达分析

在58例大肠肿瘤中,p53基因和Ki-ras基因的表达结果为:5例良性病变患者的阳性细胞数分别为57.90±16.03和87.90±3.00,9例恶变组患者的阳性细胞数分别为74.89±13.04和58.65±17.17,44例原发腺癌组患者的阳性细胞数分别为66.43±14.41和62.11±18.75。统计分析表明,良性病变组与恶变组p53基因和Ki-ras基因的表达有显著差异(t分别为2.027 1和4.782 3,P分别＜0.05和＜0.01);恶变组与原发腺癌组间无显著差异(t分别为1.664 5和0.537 1,P均＞0.05);良性病变组与原发腺癌组的Ki-ras基因表达差异显著(t为8.257 8,P＜0.01),而 p53基因表达无显著差异(t为1.1174,P＞0.05)。经相关分析表明,良性病变组p53基因与Ki-ras基因表达呈负相关,而恶变组和原发腺癌组呈正相关。

2.2 大肠肿瘤p53基因和ki-ras基因协同突变分析

对9例恶变患者和44例原发腺癌患者癌组织p53基因和ki-ras基因突变进行了PCR-SSCP分析,其中3例未出结果。50例检测结果可见,p53基因和ki-ras基因突变率均近半数(分别为22/50和23/50,P=0.841),两种基因突变率无显著差异(P＞0.05)。协同突变结果(见表2)相关分析表明,p53+/Kiras mut组淋巴结转移率、p53 mut/Kiras+组淋巴结转移率、p53+/Kiras+组淋巴结转移率无显著差异(P=1.0)。但两者同时突变对淋巴结转移有叠加作用,其转移率显著增高(77.78%),p53基因和ki-ras基因协同突变与淋巴结转移密切相关,相关系数r=0.335,P=0.017。

Tab.2 Collaborative mutation of p53 gene and Ki-ras gene in colorectal cancer

3 讨论

恶性肿瘤的发生,是多基因参与和多步骤的演化过程。恶性肿瘤形成后,癌细胞经过不断的突变和选择,其生物学行为逐步升级为恶性行,包括侵润、转移及治疗过程中发生的抗放射性、抗药性,理应涉及许多基因的的激活并参与作用,但目前仅恶性变而言,需要多少个肿瘤基因参与[4]。我们在前期研究中发现,在大肠肿瘤发生演变过程中,有多种基因构成了庞大复杂的调控网络,其中,p53基因和Ki-ras基因均位于网络的上游,其突变与外界因素直接相关,突变后通过其下游基因群,间接影响细胞周期,进而促进细胞恶性增值[5]。本实验结果也表明,大肠肿瘤,从良性病变、到良性病变的恶变、以及原发腺癌演进过程,伴随着p53基因的表达逐渐增高和Ki-ras基因表达的逐渐降低,并在良性病变阶段p53基因与Ki-ras基因表达呈负相关,而恶变和原发腺癌阶段呈正相关。提示在调控网络同一水平的基因之间仍然存在着制约或协同作用,这一结果也验证了基因突变过程与癌细胞内在功能机制的协同特征。

Land等[5]提出,肿瘤细胞的转化需要特征性癌基因的多重突变,对癌基因突变起协同作用的基因可能是细胞恶变的“启动子”。间接提示了肿瘤多基因突变,是两个或两个以上功能完全独立的癌基因激活或抑癌基因失活才致癌,并有“正调和负调基因突变,癌基因和抑癌基因的协同致恶变”的多基因协同假说,一般需要一个核内蛋白,另一个胞质内蛋白。本研究中的p53基因表达在细胞核内,而Ki-ras基因表达在细胞质内,两者的协同作用符合多基因协同假说的机制。按照共识性研究基础,大肠肿瘤的演变,包括了增殖、分化或凋亡异常,其发展进程为:息肉/早期腺瘤→中期腺瘤→后期腺瘤→腺癌→转移,期间伴随的基因异常次序为:APC/MCC→K-ras→DCC →P53→MMR。并普遍认为p53基因突变者预后差。本研究中的大肠癌的p53基因突变率(44.00%)与Ki-ras基因突变率(46.00%)均接近半数,表明了基因突变在大肠癌发生中的作用不可忽视,但在协同突变分析中,这两个基因没有发生突变者(p53+/Ki-ras+28.00%)与仅一个基因突变者(p53+/Ki-ras mut 28.00%;p53 mut/Ki-ras+26.00%)的差异并不显著,揭示单基因突变比多基因协同突变(p53 mut/Ki-ras mut 18.00%)更常见。但单基因突变对预后的影响并不显著,无基因突变患者的淋巴结转移率仅为21.43%,而单基因突变患者的淋巴结转移率略有增高,差异不显著(p53+/Ki-ras mut 35.71%;p53 mut/Ki-ras+38.46%)。多基因协同突变者的淋巴结转移率高达77.78%(r=0.335,P＜0.05),揭示了多基因协同突变的重要性。因此,监测p53基因和Ki-ras基因的协同表达和突变,有助于大肠肿瘤的早期诊断和预后判断。

[1]Vogelstein B,Lane D,Levine AJ.Surfing the p53 network[J].Nature,2000,16,408:307.

[2]Wang SP,Wang WL,Chang YL et al.p53 controls cancer cell invasion by inducing the MDM2-mediated degradation of Slug[J].Nature Cell Biology,2009,11,694.

[3]He L,He XY,Lim LP,et al.A microRNA component of the p53 tumour suppressor network[J].Nature,2007,447,1130.

[4]Ding L,Getz G,WheelerDA,et al.Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma[J].Nature,2008,455(7216):1069.

[5]侯治富,王维忠,印 璞,等.大肠肿瘤基因调控模式初探[J].中国肿瘤临床,1999,26(11):856.

[6]Land H,Parada LF,Weinberg RA.Cellular oncogenes and multistep carcinogenesis[J].Science,1983,222(4625):771.

Collaborative mutation of p53 and ki-ras genes in colorectal cancer

HOU Rui-zhe1,HOU Rui-zhi2,PENGYun-xiang2,et al.(1.Norman Bethune College of Medicine,JilinUniversity,Jilin,Changchun130021,China;2.China-Japan Union Hospital,JilinU-niversity,Jilin,Changchun130033,China)

ObjectiveTo explore p53 and ki-ras genes collaborative mutation in colorectal cancer patients.MethodsThe p53 gene and ki-ras gene expression and mutationwere detected in 58 cases of colorectal cancer patients with benign lesions,benign lesions to malignant,primary adenocarcinoma by immunohistochemical staining and PCR-SSCP method respectively.ResultsThe Expressions of P53 gene and Ki-rasgene were significantly different between benign group and malignant group.The Ki-ras gene expression of benign lesions and primary adenocarcinoma was significantly different.And in benign lesions,the expression of the P53 gene and Ki-ras gene was negatively correlated,while the malignant group and the primary adenocarcinoma showed positive correlation.The mutations between p53 gene and ki-ras gene was no significant difference in a concerted mutation.Synergistic gene mutation of p53 gene and ki-ras gene is closely related to lymph node metastasis.R=0.335,P=0.017,P＜0.05.Conclusionp53 and ki-ras gene mutation can contribute to the synergy of colorectal cancer development.Monitoring the P53 gene andKi-ras gene expression and mutation of the synergy will help the early diagnosis and prognosis in colorectal cancer patients.

p53 gene;ki-ras gene;colorectal cancer;synergistic mutation(Chin J Lab Diagn,2010,14:0917)

R735.3+4

A

1007-4287(2010)06-0917-03

吉林省科技发展计划项目(200705391)资助。吉林大学“大学生创新性实验计划”项目(2009B71067)资助

*通讯作者

侯睿哲(1987-),男,吉林大学白求恩医学院2006年级本科生,研究方向:消化道肿瘤。

2009-05-15)