丹蒲胶囊对自身免疫性前列腺炎模型IL-2、IL-8、IL-10 的影响

宋竖旗，张亚强，刘咏梅，王文娟，陈玉英，鞠大宏，吴志奎

(1.中国中医科学院广安门医院，北京 100053;2.首都医科大学中医药学院，北京 100069;3.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

近年来，自身免疫因素在慢性前列腺炎(CP)的发生发展中的作用受到越来越多的关注，国外已应用自身免疫模型进行较多的实验研究，而国内相关报到较少［1-3］。本课题在建立实验性自身免疫性前列腺炎模型的基础上，中药复方丹蒲胶囊进行干预，采用ELISA法检测治疗前后IL-2、IL-8、IL-10水平变化，从免疫调节的角度探讨丹蒲胶囊治疗慢性前列腺炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠共60只，250g～300g，购于中国人民解放军军事医学科学院动物中心(动物合格证号SCXK-(军)2002-001)。大鼠购进后常规饲养观察1周，无异常后进行实验，实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.1.2 药品、试剂 丹蒲胶囊(由丹参、蒲公英、赤芍、泽兰等10余味中药组成)，中国中医科学院广安门医院制剂室生产(批号京药制字Z20063198，规格0.4 g×60粒);对照药物:前列泰片(由益母草、萹蓄、红花、油菜蜂花粉等组成)，甘肃河西制药厂生产(批号Z10980063，规格0.44 g×60粒)。完全弗氏佐剂(批号F5881)和不完全弗氏佐剂(批号F5506)，美国Sigma公司;IL-8 ELISA试剂盒(美国R＆D公司，批号E0080r)、IL-2 ELISA试剂盒(美国 R＆D公司，批号 E0073r)、IL-10 ELISA试剂盒(美国R＆D公司，批号E0056r);DU-600紫外分光光度计(BECKMAN公司);高速冷冻离心机(BECKMAN公司)。

1.2 方法

1.2.1 抗原制备 先取雄性Wistar大鼠中的10只断脊处死，仔细剥取前列腺组织称重，冷盐水洗净，加入含等重的预先高温灭菌的0.5%TritonX-100生理盐水溶液，匀浆，12000 r/min离心30 min，取上清液，用紫外法按公式测定蛋白含量。

1.2.2 分组与模型复制 取60只雄性Wistar大鼠，按随机数字表法分为6组，即丹蒲胶囊高、中、低剂量组、前列泰组、模型组和正常组，每组10只。制作模型:测定蛋白含量后，以生理盐水稀释至40 g/L，再以完全弗氏佐剂倍量乳化。除正常组大鼠外，其余各组大鼠皮下多点注射乳化后的抗原液1ml造模［4］。

1.2.3 给药方法 造模24 h后开始灌胃给药。给药剂量参照实验动物与人体重等效剂量换算公式换算［5］。丹蒲胶囊高剂量组给药1.37 g/(kg·d)，丹蒲胶囊中剂量组给药0.91g/(kg·d)，丹蒲胶囊低剂量组给药0.46g/(kg·d)，分别相当于临床用量的15、10、5倍;前列泰组为2.2 g/(kg·d)，相当于临床用量的15倍;模型组、正常组分别给予等量生理盐水灌胃。每日灌胃1次，给药10周。

1.2.4 检测指标及方法 给药10周后，股动脉采血(储存于－80℃冰箱中备用)，处死动物。细心剥离前列腺组织固定、脱水、包埋，HE染色，光镜下观察各组动物前列腺组织形态学变化。ELISA法检测大鼠前列腺组织及外周血IL-2、IL-8、IL-10水平，按试剂盒说明书在专业实验人员指导下进行。

1.3 统计方法

采用SPSS11.5软件进行数据的统计分析，多组均数比较用单因素方差分析法。经方差分析，组间总体差异有显著性意义，且满足正态性和方差齐性时，两两比较用Student-Newman-Keuls-Test法;方差不齐选用Dunnett's法。结果以均数±标准差(±s)表示，标准水平取α=0.05，P<0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 光镜下各组病理组织学改变

正常组:前列腺组织结构正常，腺体排列及分布正常，间质内未见明显炎细胞浸润(见图1F)。模型组:前列腺腺体遭到破坏，部分腺腔内有分泌物。管腔内上皮组织完全坏死、剥脱和消失，间质及腺体充满大量弥散的淋巴细胞、单核细胞，间质组织明显变宽(见图1E)。丹蒲胶囊高剂量组:前列腺大部分腺泡结构正常，间质内炎细胞浸润不明显，部分腺腔内有分泌物，无间质水肿，与模型组比较，间质内淋巴细胞明显减少(见图1A)。丹蒲胶囊中剂量组:前列腺组织结构清楚，部分腺腔内有分泌物，管腔内可见少量单核上皮，与模型组比较，间质内淋巴细胞减少，可见散在淋巴球(见图1B)。丹蒲胶囊低剂量组:前列腺腺泡腔内有少量分泌物，间质可见分布不均的淋巴细胞、单核细胞浸润，与模型组比较，间质内淋巴细胞减少(见图1C)。前列泰片组:前列腺组织腺体排列及分布基本正常，部分腺腔内有分泌物，与模型组比较，间质内淋巴细胞减少，间质内可见淋巴细胞浸润(见图1D)。

图1 各组光镜下病理学改变

2.2 各组前列腺组织及血清IL-8变化

表1显示，与正常组比较，模型组前列腺组织和血清IL-8水平明显增高(P<0.05);丹蒲胶囊高剂量组、前列泰组前列腺组织和血清IL-8水平均明显降低，与模型组比较，差异有显著性意义(P均<0.05);丹蒲胶囊中、低剂量组前列腺组织IL-8水平亦见降低，但与模型组比较差异无显著性意义(P>0.05)。

表1丹蒲胶囊对前列腺组织及血清IL-8水平的影响(±s)

表1丹蒲胶囊对前列腺组织及血清IL-8水平的影响(±s)

注:与正常组比较:△P<0.05，△△P<0.01;与模型组比较:★P<0.05，★★P<0.01

组别 组织IL-8(pg/mg) 血清IL-8(pg/ml)正 常 组60.05±14.98 87.77±20.76丹蒲胶囊高剂量组 78.41±22.88★★ 110.39±22.03★★丹蒲胶囊中剂量组 98.40±14.35 125.27±43.56丹蒲胶囊低剂量组 110.56±40.78 137.53±57.29前 列 泰 组 82.30±24.93★★ 110.38±34.27★★模 型 组 131.42±49.29△△ 178.08±42.70△△

2.3 各组前列腺组织及血清IL-2变化

表2显示，与正常组比较，模型组前列腺组织IL-2水平明显增高(P<0.01);与模型组比较，丹蒲胶囊高剂量组、前列泰组前列腺组织IL-2水平明显降低(P均<0.05);与正常组比较，模型组外周血IL-2水平明显增高(P<0.01);与模型组比较，丹蒲胶囊高、中剂量组、前列泰组前列腺组织IL-2水平明显降低(P均<0.05)。

表2丹蒲胶囊对前列腺组织及血清IL-2的影响(±s)

表2丹蒲胶囊对前列腺组织及血清IL-2的影响(±s)

注:与正常组比较:△P<0.05，△△P<0.01;与模型组比较:★P<0.05，★★P<0.01

组别 组织IL-2(pg/mg) 血清IL-2(pg/ml)正 常 组77.47±20.86 88.12± 6.43丹蒲胶囊高剂量组 96.28±29.44★ 96.87±17.13★★丹蒲胶囊中剂量组 125.09±37.51 103.51±23.03★★丹蒲胶囊低剂量组 106.74±14.69 120.05±18.68前 列 泰 组 90.35±26.04★ 99.71±19.30★★模 型 组 140.11±61.41△△ 143.83±30.21△△

2.4 各组前列腺组织及血清IL-10变化

表3显示，与正常组比较，模型组前列腺组织IL-10水平明显增高(P<0.01);与模型组比较，丹蒲胶囊高剂量组、前列泰组前列腺组织IL-10水平明显降低(P均<0.05);与正常组比较，模型组外周血IL-10水平明显增高(P<0.01);与模型组比较，丹蒲胶囊各剂量组、前列泰组前列腺组织IL-10水平明显降低(P均<0.05)。

表3丹蒲胶囊对IL-10水平的影响(±s)

表3丹蒲胶囊对IL-10水平的影响(±s)

注:与正常组比较:△P<0.05，△△P<0.01;与模型组比较:★P<0.05，★★P<0.01

组别 组织IL-10(pg/mg) 血清IL-10(pg/ml)正 常 组63.07±14.44 79.10±17.66丹蒲胶囊高剂量组 77.84±16.50★★ 92.06±13.62★丹蒲胶囊中剂量组 95.98±21.59 93.83±25.46★丹蒲胶囊低剂量组 94.31±13.40 84.10±37.60★★前 列 泰 组 77.94±16.12★★ 92.28±22.70★模 型 组 116.26±28.00△△ 127.37±25.28△△

3 讨论

慢性前列腺炎是中青年男性的常见病、多发病，发病率高达2.2% ～9.7%［6］，该病病因复杂，病程较长且容易复发，严重危害患者的身心健康。

随着分子生物学、免疫学的发展，免疫因素在CP发病中的作用越来越受到重视，这一过程是以细胞因子为介导发生的［7］，抗炎性细胞因子、促炎性细胞因子和调节性细胞因子之间动态平衡决定该病炎症反应的程度及转归［8］。研究已发现，慢性前列腺炎患者的前列腺液或精浆中均发生过IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α 等细胞因子的变化［9、10］。

丹蒲胶囊是中国中医科学院广安门医院刘猷枋教授根据CP患者的临床症状、体征，针对其瘀阻、湿热之病机［11］组方而成。方中丹参、泽兰、赤芍、桃仁、红花诸药重在活血化瘀、导滞散结而生新，共为君药;败酱草、蒲公英、白芷清热解毒，消肿散瘀而为臣药;没药活血行气通络、王不留行通利血脉，共为佐药;川楝子行气止痛、石苇清利湿热，同为使药，诸药合用，活血行气止痛、清利湿热。临床应用40余年发现，丹蒲胶囊能明显改善慢性前列腺炎患者临床症状，降低前列腺液白细胞数，提高前列腺液卵磷脂小体密度，升高前列腺液Zn含量，对慢性前列腺炎患者前列腺液IL-2、IL-6水平有显著降低作用，推测丹蒲胶囊具有免疫调节作用。

基于以上认识，本研究在建立自身免疫性前列腺炎大鼠模型的基础上，选取IL-8(促炎性细胞因子)、IL-2(调节性细胞因子)、IL-10(抗炎性细胞因子)作为观察指标，通过观察丹蒲胶囊对以上因子的影响，探讨丹蒲胶囊治疗作用的分子机制。

研究结果:①采用前列腺蛋白结合免疫佐剂方法建立免疫性前列腺炎大鼠模型。光镜下可见，模型组前列腺腺体遭到破坏，间质及腺体充满大量弥散的淋巴细胞、单核细胞，符合前列腺炎的病理改变，表明模型复制成功。给药后发现，丹蒲胶囊各剂量组均能明显减轻或消除模型大鼠的前列腺组织炎症，为丹蒲胶囊的临床疗效提供了病理组织学依据。②ELISA结果:与正常对照组比较，模型组动物血清及前列腺组织中IL-2、IL-8、IL-10等因子水平均明显升高，说明模型动物存在自身免疫后的炎性反应;与模型组比较，丹蒲胶囊各剂量组血清及前列腺组织炎性因子水平出现不同程度的下降，且以丹蒲胶囊大剂量组为优，呈现一定的量效关系。值得注意的是，课题组检测到的抗炎性细胞因子IL-10在给药10周后，其水平明显低于模型组。这是因为在炎症的慢性阶段，抗炎性细胞因子IL-10水平增高来对抗促炎性细胞因子的表达［7］。而丹蒲胶囊给药后，前列腺组织的炎症损伤得以修复，IL-10水平逐渐恢复至正常水平。

综上可知，自身免疫因素参与了慢性前列腺炎的发病过程，在这个过程中，细胞因子间的动态平衡受到破坏。中药丹蒲胶囊干预后，这个平衡得以恢复。该研究从免疫调节的角度揭示了中医药治疗慢性前列腺炎的分子机制。

［1］Vykhovanets EV，Shukla S，MacLennan GT，et al.Il-1 betainduced post-transition effectofNF-kappaB providestimedependent wave of signals for initial phase of intrapostatic inflammation［J］.Prostate，2009，69(6):633-643.

［2］Bagavant H，Tung KS.Failure of CD25+T cells from lupus-prone mice to suppress lupus glomerulonephritis and sialoadenitis［J］.J Immunol，2005，175(2):944-950.

［3］Rivero V，Canmaud C，Riera CM.Prostatein or steroid binding protein(PSBP)induces experimental autoimmune prostatitis(EAP)in NOD mice［J］.Clin Immunol，2002，105(2):176-184.

［4］张亚强，王炎，李敏，等.大鼠前列腺组织抗原蛋白诱导自身免疫性前列腺炎模型的建立［J］.中国中西医结合外科杂志，2008，14(6):584-587.

［5］何诚.实验动物学［M］.北京:中国农业大学出版社，2006.283.

［6 ］Krieger JN，Lee SW，Jeon J，et al.Epidemiology of prostatitis［J］.Int J Antimicrob Agents，2008，31 Suppl 1:S85-90.

［7］郭应禄，李宏军.前列腺炎［M］.北京:人民军医出版社，2007.346.

［8 ］Jang TL，Schaeffer AJ.The role of cytokines in prostatitis［J］.World J Urol，2003，21(2):95-99.

［9 ］Stancik I，Plas E，Juza J，et al.Effect of antibiotic therapy on interleukin-6 in fresh semen and postmasturbation urine samples of patients with chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome［J］.Urology，2008，72(2):336-339.

［10］侯四川，冯元法，王春玲.慢性前列腺炎病人前列腺液中IL-2、IL-1β、IL-8、TNF-α 和 PGE2的变化及意义［J］. 青岛大学医学院学报，2007，43(6):497-499.

［11］刘猷枋，张亚强.中西医结合泌尿外科学［M］.北京:人民军医出版社，2007.229-230.