静安口服液对小儿多发性抽动症模型大鼠抽动行为及脑组织、血浆5-羟色胺含量的影响

隆红艳，张 骠，谈瑄忠

(1.南京中医药大学，江苏南京 210046;2.南京市中医院，江苏南京 210001)

小儿多发性抽动症是一种儿童期起病、通常伴有运动和行为异常的慢性神经精神障碍性疾病。1885年法国医生Gille de la tourette首先报道了9例具有本病临床特征的患儿，本病又称为Tourette综合征(Tourette Syndrome，TS)［1］。最新流行病学研究资料表明，本病的发病率在1.0% ～4%之间，且有逐年增高的趋势，发病年龄高峰在4岁～12岁之间，男女性别比为3～4∶1。本病是一个具有复杂病因和多样表型的临床综合征，其病因和发病机制目前仍不十分清楚，一般认为发病与遗传和神经递质系统的异常有关。单胺类神经递质在中枢神经递质系统中扮演着非常重要的角色，5-羟色胺(5-HT)是仅次于多巴胺的单胺类神经递质，作为中枢神经系统功能调节的重要神经递质，参与多种生理功能，并与情绪和冲动控制等密切相关，因此近年来有关Tourette综合征的研究，5-HT也是研究热点之一［2］。

静安口服液具有滋肾平肝、息风化痰功效［3、4］，6年来经治200余例患者，已获得较为显著的疗效。本实验将观察其对Tourette综合征模型大鼠抽动行为的改善、脑组织及血浆5-HT含量的影响及其相互关系，以期进一步阐明Tourette综合征的发病机制及静安口服液的效应机理。

1 材料

1.1 药品与试剂

静安口服液由南京市中医院制剂室提供，每毫升含生药 1.1g，批号 081024。DOI［选择性 5-HT(2A/2C)受体激动剂 1-(2，5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane］由 Sigma公司生产，上海博蕴生物公司提供。硫必利片由江苏恩华药业集团有限公司生产，批号20070502。

1.2 实验仪器

高效液相仪(HPLC):日本岛津L-ECD-6A型;台式冰冻离心机:美国BECKMAN公司GS-15R型。

2 方法

2.1 TS大鼠模型及测试方法的建立、静安口服液对抽动行为的影响［5、6］

雄性SD大鼠40只，200g±10g，分笼饲养，常规饮食，随机分为空白组、模型组、静安组、硫必利组。模型组、静安组、硫必利组腹腔注射1mg/(kg·d)的DOI，诱导大鼠抽动模型，空白组腹腔注射相同剂量的生理盐水。静安组、硫必利组同时分别灌服静安口服液、硫必利，空白组、模型组灌服同剂量生理盐水。用药后大鼠抽动行为可持续2h～3h，连续给药10d左右，大鼠产生较持久的抽动行为。

大鼠腹腔注射1mg/(kg·d)的DOI后出现头部抽动、耸肩及口腔运动、理毛、舔食前爪等刻板动作，其中头部抽动明显且容易分辨，作为该模型诱导成功的观察指标。

大鼠的抽动及刻板运动测试:治疗20d后将各组大鼠逐个放入观察笼内，适应5min后，按文献［1］TS动物模型中对抽动、刻板行为的评分方法并加以改良，在最后1次给药后1h，进行双盲观察1h，5min记录1次，并记录总分。大鼠的抽动及刻板运动评分标准如下:0分:无抽动或刻板运动;1分:耸肩及口腔运动、理毛、舔食前爪等刻板动作或旋转行为;2分:头和颈部上下运动过多;3分:头、颈部上下运动过多加旋转行为;4分:头向侧摆合并头和颈部的上下运动过多。

2.2 5-HT的测定

2.2.1 样本采集 脑组织:第20天灌胃、腹腔注射后，夜间禁食不禁水，第21天各组大鼠脱颈处死，冰碟上迅速取出脑组织，称重后放入－80℃冰箱保存。血浆:第20天灌胃、腹腔注射后，夜间禁食不禁水，第21天眼眶取血4ml～5ml，分别入EDTA抗凝管，冷冻离心(3000r/min，10min)，取血浆上清液－80℃冰箱保存。

2.2.2 样本处理与测试 脑组织样本处理:取大鼠脑组织0.7g，加入0.5 ml 10%HClO4溶液匀浆沉淀蛋白，转移至5 ml的具塞试管中，用三蒸水定容至刻度。取上述样品液1ml 12000r/min离心15min，取上清液490μl于PE 管中，加入10μl 10μg/ml内标溶液，涡旋30s，20μl注入色谱分析仪分析。血浆样本处理:取300μl大鼠血，加入50μl 30% 三氯乙酸，混匀沉淀蛋白，12000r/min离心10min，取上清液100μl于PE管中，20μl注入色谱分析仪分析。色谱条件:流动相为柠檬酸:35mmol/L，磷酸二氢钠:45mmol/L，庚烷磺酸钠:2mmol/L，EDTA:0.25mmol/L，乙腈:5.5%(v/v)，NaOH 调 pH=4.15;流速为1.0ml/min;柱温为30℃;色谱柱为Diamonsi C18(150×4.6mm，5μm)不锈钢柱。

3 结果

与空白组相比，模型组抽动及刻板运动显著性增多(P<0.01)，静安组与硫必利组较模型组的抽动及刻板动作明显减少(P<0.05)，提示应用DOI成功诱导了大鼠抽动模型，类似Tourette综合征的临床表现，表明静安口服液明显减少抽动和刻板动作次数，具有良好的对抗抽动及刻板行为作用。

表1 静安口服液对TS模型大鼠抽动或刻板运动评分的影响(n=10，±s)

表1 静安口服液对TS模型大鼠抽动或刻板运动评分的影响(n=10，±s)

注:与空白组比较:**P<0.01;与模型组比较:△P<0.05

组别 剂量(g/100g)抽动及刻板运动空 白 组 —6.70±3.65模 型 组 — 18.20±2.97 静 安 组 1.1 12.30 ±3.62△硫 必 利 组 0.0025 14.80±3.08△

模型组大鼠脑组织中5-HT含量较空白组明显升高(P<0.01)，治疗组(静安组与硫必利组)脑5-HT含量较模型组明显降低(P<0.01)，静安组与硫必利组有显著性差异(P<0.01)，说明抽动症模型建立成功;静安口服液和硫必利可能通过降低脑组织5-HT含量，从而发挥治疗TS的作用;静安口服液比硫必利更好地降低了脑组织中5-HT的含量。

表2 静安口服液对TS模型大鼠脑组织5-HT的影响(n=10，±s)

表2 静安口服液对TS模型大鼠脑组织5-HT的影响(n=10，±s)

注:与模型组比较:△△P<0.01;与硫必利组比较:##P<0.01

组别 剂量(g/100g) 5-HT(ng/g)空 白 组 — 315.73±95.48△△模 型 组 — 815.12±141.60静 安 组 1.1 320.95± 60.58△△##硫 必 利 组 0.0025 503.92±66.41△△

与空白组相比，模型组血浆5－HT水平无明显变化;治疗组(静安组和硫必利组)血浆5-HT水平较模型组显著降低(P<0.05)，静安组和硫必利组相比无显著性差异，提示静安口服液具有良好的降低血浆5-HT含量的作用。

表3 静安口服液对TS模型大鼠血浆5-HT的影响(n=10，±s)

表3 静安口服液对TS模型大鼠血浆5-HT的影响(n=10，±s)

注:与模型组比较:△P<0.05

组别 剂量(g/100g) 5-HT(ng/ml)空 白 组 —197.17±104.23模 型 组 — 259.20±129.71静 安 组 1.1 128.71±66.93△硫 必 利 组 0.0025 121.16±48.69△

4 讨论

中枢5-HT神经纤维从中缝核发出，广泛投射到脑内的各个区域，如大脑皮质、纹状体、黑质和海马等，是仅次于多巴胺的单胺类神经递质，它通过释放神经递质5-HT与神经细胞膜上相应的受体结合而发挥作用。在中枢神经系统，5-HT能神经元对不同脑区神经元活动发挥兴奋或抑制的调节作用，主要取决于与之相结合的受体类型和分布位置。5-HT受体可分为5-HT1～5-HT7七大种亚型，每一种还可以被进一步分型，其作用极其广泛复杂，有的亚型生理功能尚不清楚。一般而言，中枢神经细胞受体兴奋性增强后，可促使更多的神经递质与之结合，从而使游离的神经递质水平降低，如多巴胺等的代谢过程即如此。但本实验结果显示，运用选择性5-HT(2A/2C)受体激动剂后，模型组脑组织游离5-HT水平明显升高。这看似矛盾的结果，可能与5-HT受体功能的复杂性有关。比如大脑皮层分布有大多数的5-HT受体亚型，激活皮层突触前的5-HT1A或5-HT1B自身受体，可使皮层5-HT的水平明显降低，而激活突触后的受体是加强或抑制皮层神经细胞的活动，则取决于突触后受体亚型的构成情况。Bobula等报道［7］，选择性 5-HT(2A/2C)受体激动剂DOI可通过降低大鼠前额皮层的神经细胞静息K+的电导性，使细胞膜去极化，从而增强细胞的兴奋性和动作电位的发放频率，加强神经细胞的活动，使皮层5-HT的水平明显升高。此外，很多5-HT受体亚型都有易化5-HT等神经递质释放的作用。如有实验表明，海马中5-HT3受体亚型对5-HT递质的释放具有正反馈的作用［8、9］，关于其他部位5-HT2受体亚型是否存在此机制，尚需进一步阐明。总之，本实验观察到的运用选择性5-HT(2A/2C)受体激动剂后脑组织游离5-HT水升高现象，可能与其刺激突触后受体亚型、降低神经细胞静息K+的电导性或激活易化5-HT递质释放功能等因素有关。

本实验应用DOI(选择性5-HT(2A/2C)受体激动剂)成功诱导了大鼠抽动模型，类似Tourette综合征的临床表现，说明5-HT活动异常有可能是Tourette综合征的发病原因之一。实验结果表明，5-HT分泌过多导致抽动发生，静安口服液明显减少抽动和刻板动作次数，具有良好的对抗抽动及刻板行为作用;静安口服液明显降低脑组织与外周血中5-HT水平，其降低模型大鼠脑组织中5-HT的作用较硫必利明显，降低模型大鼠血浆5-HT的作用与硫必利相当。推测其作用机理主要是拮抗5-HT受体、抑制5-HT的异常释放，从而降低突触前5-HT神经元的过度支配;另外，尽管硫必利等治疗Tourette综合征常用药能抑制抽动症状，且起效较快，但是由于其具有嗜睡、肝功能损伤、肌肉强直及运动失调等副作用，不适合长期应用。相比之下，静安口服液具有副作用小、疗效确实而持久，并同时能调节患儿身体阴阳平衡和脏腑功能、全面改善患儿身体状况的独特优势，因而颇具发展潜质［4］。

有关中枢与外周5-HT含量变化相互关系的研究不多，本实验观察到二者变化基本一致，即中枢与外周皆有模型组含量升高(血浆中呈增高趋势)、经治疗后其含量明显降低且成正相关现象。但关于脑组织与外周血5-HT含量的变化与Tourette综合征发生之间的关系，以及静安口服液在此关系中的影响作用，则需进一步深入研究。

［1］刘智胜.小儿多发性抽动症［M］.北京:人民卫生出版社，2002:4-15.

［2］姚阳，麻宏伟.Tourette综合征神经生物学研究进展［J］.国外医学儿科学分册，2005，32(3):137-140.

［3］张骠.小儿多发性抽动症中医证治特点及其研究述略［J］.江苏中医药，2004，25(9):1-3.

［4］张骠，孔群，林节，等.静安口服液为主治疗小儿多发性抽动症的临床研究［J］.南京中医药大学学报，2008，24(3):156-159.

［5］Hayslett RL，Tizabi Y.Effects of donepezil on DOI-induced head twitch response in mice:implications for Tourette syndrome［J］.Pharmacol Biochem Behav，2003，76(3-4):409-415.

［6］姚阳，麻宏伟，石玉秀.DOI诱导的大鼠头部抽动模型脑内多巴胺转运体的研究［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2006，15(3):351-354.

［7］Bobula B.Different receptor subtype are involver in the serotonininduced modulation of epileptiform activity in rat frontal cortex invitro［J］.J Physiol Pharmacol，2001，52:265-274.

［8］Blier P，Bouchard C。Functional characterization of a 5 -HT3receptor which modulates the release of 5–HT in the guinea-pig brain［J］.Br J Pharmacol，1993，108:13 – 23.

［9］Galzin A M，Langer SZ.Modulation of 5– HT release by presynaptic inhibitory and facilitatory 5–HT receptorsin brains lices［J］.Ad Bioscience，1992，82:59 – 62.