细胞规模化生产过程中的质量控制

赵 蕾 管 宇 梅建国 唐 娜 李坤林

（山东省滨州畜牧兽医研究院 256606）

细胞规模化生产过程中的质量控制

赵 蕾 管 宇 梅建国 唐 娜 李坤林

（山东省滨州畜牧兽医研究院 256606）

细胞大规模培养在生物制药和疫苗生产领域是一项基础工作，是整个生产工艺过程中的中心环节，具有十分重要的地位。细胞培养基质的优劣直接决定终端产品的质量与疗效，因此严格做好细胞培养过程的质量控制显得尤为重要。笔者从事细胞培养及规模化生产多年，对细胞培养和规模化生产过程中的技术环节有着较为深刻的体会。现就这些相关问题和注意事项进行简述和探讨。

1 规模化细胞培养明确对工作者的基本要求

细胞规模化培养不能完全等同于细胞生物学实验室工作，生产者首先应具备的基本素质：（1）除掌握操作技术之外，尚需明白各种操作的基本原理。（2）须具备判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力：对细胞生长的好坏要根据理论知识和自己的经验来判定其生长的稳定性，并且根据判定结果来进行适当的应用；如果怀疑细胞被污染还要能够对污染情况做出预判。（3）熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状及与此有关的基本理论知识。（4）应该具有较高的无菌意识：培养用品与非培养用品、已消毒与未消毒品、清洁区与污染区的材料应严格分开存放或单独处理，避免溢出、溅出和产生气溶胶，吸入或吸出液体时避免倾倒或触碰细胞培养瓶瓶口。

2 确保细胞培养原料的质量可靠

2.1 培养基 规模化细胞培养对培养基的一致性要求非常高，一年之内所用培养基的批号不宜超过2个。

2.2 血清 观察血清融化后的颜色和清亮度，颜色偏红或色浅、有大量沉淀者不能使用；血清冻融后的最上层无色透明，活力最差，使用前应该摇匀；长时间冻存的血清融化后出现的沉淀物可能会抑制细胞生长，应弃去沉淀物；避免反复冻融；生产中尽量使用同一批号血清。血清溶化后应尽快用完，4℃保存期最好控制在2周之内。根据实际情况，血清的灭活步骤可以省略。

2.3 胰酶 （1）胰酶极易潮解，需储存在冷暗干燥处；（2）需要低温配制；（3）胰酶分散细胞的活性与其浓度、温度和作用时间有关，不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样，所以应当具体情况具体对待；（4）Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强，要选择最佳环境进行胰酶的应用；（5）胰酶消化过度造成细胞损伤，所以应该控制好胰酶对细胞的消化时间。大规模快速操作过程中，由于血清中和作用，胰酶不必弃之干净，但是某些病毒如猪乙脑病毒对胰酶敏感，应注意胰酶的残留量，以免影响病毒增殖滴度。

2.4 水 培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡，所以细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质，金属蒸馏器制备的蒸馏水，可能会含有某些金属离子，一般不作为培养用水，常用玻璃或石英蒸馏器制备的三蒸水或超纯水净化装置制备的超纯水，超纯水的电导率应达到18.2MΩ，最好用龙头瓶贮存，存放时间一般不应超过2周。

2.5 试剂 应选用分析纯，一旦完成供应商评估做好选择后，不宜轻易更换供应商，还要做到保质期内同一批号，以保证其质量稳定。

3 保持工作环节操作上的一致性

为避免造成人为的差异，应将所有操作程序如洗刷、消毒、配液等，制定出统一的规范和要求，并在一定时间内保持相对稳定。

3.1 洗刷与消毒 （1）培养瓶的清洗与消毒。浸泡：新细胞培养瓶使用前应先经自来水简单刷洗，然后用稀盐酸溶液(5%)浸泡过夜；培养后的细胞培养瓶清除培养基后应立即浸入自来水中，注意让水能完全进入瓶皿中，不应有气泡。刷洗：浸泡后的细胞培养瓶要用毛刷沾洗涤剂洗涤，以除去器皿表面附着较牢的杂质；洗刷时应特别注意洗刷瓶角部位；已掉毛的毛刷不可使用，以免裸露的铁丝摩擦内壁而出现玻璃划痕。浸酸：刷洗不掉的极微量杂质经过硫酸和重铬酸清洁液浸泡剂的强氧化作用，可被除掉，清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，浸泡时，器皿要充满清洁液，勿留气泡，浸泡时间应达6h以上。冲洗：刷洗和浸酸后都必须用自来水充分冲洗，每瓶都得用水灌满，倒掉，重复五次，然后用纯化水重复冲洗3次。漂洗：先用蒸馏水充分冲洗，使之不留任何残迹，每瓶都得用蒸馏水灌满，倒掉，重复3次以上，再用超纯水漂洗3次，晾干备用。包装：包装要及时，防止落入灰尘引起二次污染。灭菌：按规程操作，180℃干烤2～3h。（2）胶塞的清洗与消毒。新购置的橡胶塞在2%的NaOH溶液内煮沸15min，用饮用水冲洗后再用4%的盐酸溶液煮沸15min；用过的胶塞，先经渡槽内的消毒液浸泡消毒后，随后以1%洗液煮沸30min，再用刷子刷净。用饮用水和纯化水分别冲洗3～5遍后再浸泡在纯化水中24h以上。精洗灭菌：捞出后，用超纯水冲洗2～3遍后，晾干包装，121℃湿热灭菌40min。

3.2 配液 （1）各种培养用液(培养液、胰蛋白酶、Hanks 液、NaHCO3、抗菌素液)均应由专人负责配制，制备浓度精确、灭菌可靠；所有制备好的溶液和试剂瓶上都要有标签，注上名称、浓度、消毒与否和制备日期，并保证做到严格按规程进行操作。（2）培养基的配制注意事项：配制用水及调pH试剂用水均需新近制备；配制用器皿均需清洗烤干；采用15～30℃的水配制，充分溶解每一种成份，在配制过程中不需加热助溶；控制调节pH用酸、碱加入量，保证培养基渗透压；过滤完以后要进行无菌检验；在使用过程中要注意保存期限。

4 保证细胞培养条件和环境的稳定

4.1 温度 35～37℃，特别是注意不要高于这个范围的最高值，要对培养温度进行定期的验证。

4.2 气体 95%空气/5%CO2。

4.3 酸碱度 pH7.2～7.6(酚红指示)，注意培养基经过过滤后，pH会有所升高，所以过滤后要进行pH的监测。

4.4 渗透压 血浆渗透压一般为290 Osm/kg，并且不可超出280～320 Osm/kg的范围。

5 严格控制可能对细胞培养带来的污染

细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物，分为物理污染、化学污染和生物污染(细菌、霉菌、病毒、支原体污染)，细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。

5.1 物理因素对细胞产生的影响和应对措施 细胞和细胞培养液等培养试剂暴露于放射线、辐射(紫外线或荧光)或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。所以使用前应将培养液恢复至室温，培养用试剂应尽量避免存放于光照之下，保持细胞培养环境的温度稳定。

5.2 化学性污染和应对措施 （1）血清：选用同一批次的血清，减少成份差异，新购血清使用之前要进行预试验。（2）培养液及试剂：选择高纯度的试剂；正确的使用浓度、正确储存；在保质期内使用；避免高压蒸汽灭菌试剂中的化学物质残留。（3）水：使用新鲜超纯水。（4）培养用器皿：避免生产过程中有毒物质残留、消毒剂和清洗剂的残留、包装纸残留和操作时烤焦的瓶塞。（5）培养箱：避免CO2混有有毒气体及消毒剂和清洗剂的残留。

5.3 生物污染和应对措施

（1）容易发现的生物污染包括细菌、霉菌和酵母菌。细菌污染：污染迅速、黑色细沙状，可有不同的外形，培养液浑浊变黄，对细胞生长影响明显，有抗生素存在时可长期带菌。霉菌污染：培养液清亮；培养2～3d出现絮状杂质，细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但长时间则细胞的活力状态变差。酵母菌污染：培养液清亮，培养瓶底部出现较大颗粒，单个或聚集成团，细胞仍可生长，但长时间则细胞的活力状态变差。三种污染均来源于灭菌不彻底的培养器皿，污染的试剂与器材，空气中常见菌，工作环境潮湿；人体带菌。预防措施：要避免产生着三种污染均需要彻底灭菌，在有效期内使用；试剂用前检菌；环境及设施消毒；正确的无菌操作方法。

（2）不容易被发现的生物污染：包括支原体污染、病毒污染和细胞污染。支原体污染：污染严重，难发现。显微镜下看不到，不引起培养液浑浊和pH改变，营养要求高，不容易用传统的微生物培养法检测到，难去除，不能通过过滤清除大多数抗生素对其无效。病毒污染：难发现，隐性感染，无病变，如1型圆环病毒感染，难清除，无法药物控制，一旦污染只能废弃，严格的宿主性，自限性，对操作人员存在潜在危险。细胞污染：难于发现，若出现传代细胞的生长速度异常，考虑交叉污染。来源：支原体污染—被污染的种子批，人体组织及体液支原体，飞沫传播，牛血清中的支原体。病毒污染—病毒生产过程中漏毒，细胞株带毒，血清及其他动物源性试剂，人体带毒。细胞污染—细胞系交叉污染。预防措施：支原体污染：保证细胞及血清的来源，确保基质和器材无菌，细胞培养时避免交谈，操作结束时消毒台面，定期检验，定期更换细胞，做好详细的细胞记录。病毒污染：要进行种子批的外源病毒检验和原辅料检验；建立良好的生产规章制度。细胞污染：同一时间只传同一种细胞，每种细胞要有单独的培养液及胰酶，建立细胞库和种子批，定期更换细胞。

体外培养细胞是个系统的工程，在培养过程特别是规模化生产过程中的很多因素都有可能造成生产的失败，所以还需要做好详细的培养计划，把培养过程中的每个环节细化，把可能造成污染的因素提前排除或预防，各项操作要严格执行标准操作规程和各项规章制度，这样才能保证生产出高质量的产品。

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1007-1733(2010)06-0078-03

2010–03–14）