猪伪狂犬病诊断检测方法的研究进展及应用

邢俊玲 高付城 （山东省武城县畜牧水产局 253300）

近年来，全世界的畜类受到传染的病毒种类和数量都有所增加，其中猪伪狂犬病毒就是其中一种。根据研究证明其属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科猪疱疹病毒I型(Su1d HerpesviruS I，SHv-I)，可引起包括猪在内的多种家畜和野生动物共患一种急性传染病。该病对养猪业危害严重，主要引起的临床症状有：仔猪高热，中枢神经病状及较高死亡率，成年猪则长期潜伏感染，成为保毒宿主和主要的传染源。世界上40多个国家均有本病的报道发生，国内也有大范围的流行，对全世界的养猪业造成严重的经济损失。本文主要对血清学、分子生物学诊断与检测方法，以及鉴别诊断方法进行了综述。

1 临床诊断和病理组织学检测

成年猪无明显症状，母猪流产或产死胎，仔猪表现神经症状，肌肉震颤，严重时四肢划水样运动，体温升高达41～42℃。取样本的脑和脊髓做组织切片，苏木素-伊红染色后观察呈现非化脓性脑炎变化，其他大体剖检特征不明显。在神经细胞、胶质细胞和毛细血管内皮细胞可检出A型核内包涵体。

2 病原学诊断技术

此种方法也被称为诊断PRV的黄金标准。病毒分离时可以采集病猪的组织有：肾脏、脑、肝、脾及扁桃体，匀浆后加上双抗，接种到敏感细胞，直至出现特征性细胞病变(CPE)。这种方法的敏感性较差[1]。

3 核酸探针检测技术

探针技术由于其具有特异性良好、敏感程度高的优点，广泛用于PRV的诊断和检测中。Rirtle等首次使用核酸探针技术鉴定了野外分离的PRV，从而获得了流行病学的研究资料。其后，用生物素和地高辛标记的探针从三叉神经节诊断出PRV DNA，并进行了原位杂交，从单细胞的水平上检出存在的潜伏感染 (Maes等)。国内也存在利用探针检测技术的研究，采用32P探针标记PRV全基因组和重组质粒应用斑点杂交技术，从而获取培养物中的PRV存在的信息，能检测出10pg的PRV–DNA，并具有较高的特异性(郭万柱等1991)[2]。

4 聚合酶链式反应(PCR)检测技术

4.1 常规PCR 80年代建立成熟起来的PCR技术，不仅给分子生物学的基础理论带来重大的进展，也给检测病毒提供了方便快捷的新技术，因为其快速、特异、敏感，且安全可靠等明显优势，在检测猪伪狂犬病毒方面得到了广泛应用。目前，主要根据病毒生存必须的糖蛋白基因和毒力基因为模板设计引物，检测的基因片段主要有gB、gD、gG和gE等，其中gD基因是该病毒的主要中和抗原基因。如Echeverria M G等以PRVgD 基因为模板设计了一对引物，利用PCR法对19头猪的组织样本进行了检测，结果表明有15头PCR反应阳性，而病毒分离只得到了3株PRV。周复春等应用PCR技术进行了PRV的检测，并对潜伏的感染部位也进行了相应的研究。其中检出率最高的组织为三叉神经节，几乎为100%[3]。石建平等对常规PCR法进行了改进，提高PCR的效率，使PCR技术更趋于实用化，根据gD 基因设计一对引物，选用高速离心和短时间100℃水浴释放模板，将试验缩短到 4h 内完成[4]。2009年，陈本龙等根据gD 基因设计引物，成功建立了检测PRV的PCR体系[5]。

4.2 鉴别PCR Katz等根据gE、TK基因设计的套式PCR能将PRV野毒株和不同疫苗株有效地鉴别开[6]。刘丽娜等设计了与PRV的gB、gD、gE基因的3对引物，建立了能有效区分野毒株和基因缺失疫苗毒的多重PCR诊断方法，敏感性试验结果表明，多重PCR可以检测到106pg三基因缺失疫苗毒或756pg PRV野毒的核酸模板量[7]。

5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA是目前最为广泛应用的一种免疫检测方法，也是被国际贸易制定检测PRV的方法之一。它是以物理方法将抗体(或抗原)吸附在固体载体上，随后的一系列免疫学和酶促生化反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定实验。酶联免疫吸附试验适用于实验室大批样品检查，产地检疫，流行病学调查和无本病健康猪群的建立，目前，国际上有各种商品化ELISA试验盒出售。

Moutn(1978)[8]，Afshar(1987)[9]等分别建立了检测伪狂犬病病毒抗体的间接ELISA方法。国内蒋玉雯等(1988)[10]建立了检测伪狂犬病病毒抗体间接ELISA方法，认为ELISA敏感性高，且快速、简便，适于大面积血清学调查。

5.1 gE-ELISA gE-ELISA是一种灵感度很高的ELISA，它是根据疫苗株缺失的糖蛋白构建的一种鉴别ELISA。荷兰学者 Van Oirschot 等(1988，1989)建立了检测 PRV gE抗体的竞争酶联免疫吸附试验(gE-ELISA)。Herdchek公司和gE抗体检测试剂盒是一种阻断gE-ELISA，该方法是一种阻断gE-ELISA，由于涉及到全病毒，因此存在一定的安全隐患，结合基因工程的发展，给新型gE-ELISA的发展和建立提供了思路，Kimman等(1996)将一段gE基因(60-1020bp)融合到PRVgG的信号序列下游，在昆虫细胞中获得表达，并以该表达产物和一种抗gE的单抗建立一种间接双抗夹心gE-ELISA。

5.2 gC–ELISA gC是PRV病毒的一种主要糖蛋白但并不是病毒感染所必需的，能够诱导细胞免疫应答且为病毒的主要中和抗原之一。Kit等利用牛传染性鼻气管炎病毒基因缺失株(IBRV)作为载体表达，gC作包被糖原，建立了gC–ELISA。该方法和许多种检测方法比较，证明此方法特异敏感。Van Oirschot等ELISA和中和试验检测感染猪血清，进行比较后发现，gC–ELISA和gE-ELISA方法较为敏感。

5.3 gG-ELISA Marchioli和Cook等建立了阻断gG-ELISA技术，该方法较常规ELISA方法敏感性低。唐勇等利用gG-ELISA区分出gG基因缺失疫苗猪和野毒感染猪。

6 乳胶凝集实验技术(LA)

乳胶试验凝集技术是利用抗原和抗体特异性结合的特点，将抗原先用乳胶包被，然后再与相应血清反应，几分钟内即可得出结果。王泽州等于2001年报道利用此种方法对四川省的20个猪场进行了血清检测，阳性率为14.7%，少数猪场阳性率达到95%。罗勇等利用乳胶凝胶实验技术对疑似猪瘟病的病猪进行了猪伪狂犬病毒的检测，230份血清中阳性率11%[11]。

7 血清中和实验技术(SNT)

SN是检测病毒比较经典的血清学方法，应用比较方便，很多国家都采用此法检测PRV。Boelaert F等应用SN对比利时北部地区4个猪场的母猪进行了血清学调查，血清阳性率分别为68%、60%、43%、18%[12]。李晓慧等采用SN和LAT两种方法对吉林省8个地区1050份血清进行了检测，确定吉林省PR血清阳性率为21.7%，两种方法血清检出率经统计学分析准确性差异不显著[13]。邱德新等应用血清中和实验(SNT)和伪狂犬病乳胶凝集实验(LAT)诊断试剂盒进行了PRV抗体效价测定和相关性分析，结果表明两种方法检测结果符合率高，特异性强，LAT比SNT敏感、快速简便和实用[14]。

8 琼脂免疫扩散试验(AGID)

Gutekunst D E(1997)首次报道了利用微量琼扩试验检查猪血清中PRV抗体，由于AGID技术操作简单。结果准确，无需特殊设备，与SNT技术相比有很大的优势，因此适用于基层兽研单位和大型猪场的现场的定性诊断及猪群隐形无感染的普查。吴斌等(1997)将AGID和SNT进行了比较试验，发现与SNT的阳性符合率为94%，可以作为一种检测伪狂犬病和抗体水平的检测。代明娟等(2002)利用AGID技术对5个猪场进行了抗体检测，结果分析表明猪场的血清阳性率为80.0%，再一次显示了AGID 技术的简便和快捷[15]。

9 结语

目前，可以用来诊断猪PRV的多种检测手段中，传统检测手段可靠，但往往操作较复杂，或耗时较长，实际应用中有一定的困难。血清学检测手段，尤其是研制成功的部分ELISA试剂盒操作简单，方便，不需要使用昂贵复杂的仪器，已经被广泛应用，特别是鉴别ELISA试剂盒可鉴别野毒感染和一毛免疫动物，但一些ELISA方法还不够完善。分子生物学方法特别是PCR技术，随着研究的深入将更加趋于敏感、简便、快速、实用。建立和完善用于我国的PR控制和消灭该病的诊断方法，是我国广大兽医科研工作者面临的重大课题之一。

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