基因工程在提高植物抗逆性上的研究进展

张启鸣

（大连大学 生物工程学院,辽宁 大连 116622）

基因工程在提高植物抗逆性上的研究进展

张启鸣＊

（大连大学 生物工程学院,辽宁 大连 116622）

筛选具有抗性的目的基因,通过不同方式转入到受体细胞,并使其在受体细胞中表达,以提高植物的抗逆性。利用基因工程提高植物抗逆性具有广阔发展前景。

基因工程;植物;抗逆性

在自然环境中,植物的生长发育往往受到干旱、高温、低温、盐渍、重金属、氧化等逆境胁迫。利用基因工程可以把抗逆目的基因经体外切割、拼接与重组后,引人到受体细胞,使其在受体内进行复制、表达,按人们预先设计的要求改变受体细胞的遗传特性,然后由转化细胞再分化出有预期新性状的工程植株,这些新植株就具有较高的抗性。

一、目的基因的筛选与修饰

伴随着分子生物学和植物细胞及组织培养技术的发展,人们能够从生化及分子水平上认识植物对逆境胁迫的抗性机理,并且从其遗传物质中筛选出与抗性机理有关的基因,并对它们进行修饰,这就是目的基因。

植物的耐盐、耐温机理是多方面的。盐地碱蓬是一种具有很强抗逆性的真盐生植物,目前从盐地碱蓬已克隆出、可作为抗盐关键基因而进行基因工程操作的目的基因主要四种:合成渗透调节物质的关键酶基因、调控抗氧化防御反应的抗氧化基因、离子平衡的调节基因和盐胁迫信号转导的相关基因[1]。△’-二氢吡咯 -5-羧酸合成酶基因（SsP5CS）和肌醇-1-磷酸合成酶基因（SsIPNS）,两种基因已从盐地碱蓬成功克隆出来,它们分别是脯氨酸合成及肌醇合成的关键酶基因,在盐胁迫下,两者在转录水平均有升高,由此推断它们可能与抗盐特性有一定关系。[2-3]M PA激酶是重要的盐胁迫信号转导通路之一[4],目前已从盐地碱蓬分离出M PA激酶基因,该基因读码框长1572bp,编码一个含524个氨基酸的蛋白质,在低温、干旱和高盐胁迫下,其转录水平均有升高。[1]一般认为,Na+离子是造成盐害的主要离子,已从盐地碱蓬克隆出液泡膜Na+/H+反向转运蛋白基因（SsNHX1）,它在盐诱导下显示高表达。[5]但也有报道认为,渗透胁迫下K+营养不足是造成植物对盐敏感的关键因素。[6-7]

甜菜碱是高等植物在逆境条件下重要的渗透调节物质,但某些植物由于体内缺少合成甜菜碱的相关酶,如甜菜碱醛脱氢酶（BADH）、胆碱氧化酶（COD）等,而无法合成甜菜碱。[8]应用植物基因工程技术,将外源甜菜碱基因导入非甜菜碱积累种或使其过量表达,是提高植物抗逆能力,培育抗逆新品种的一条有效途径。[9]目前,已经从菠菜、甜菜、山菠菜、大麦、高粱等多种植物中克隆了甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因。[10-14]Deshnium等[15]成功地从节杆菌中克隆了编码胆碱氧化酶（COD）的基因codA,并将其导入蓝藻,提高了对盐害和低温的抗性。Rathinasabathi等[16]成功地将烟草中的胆碱单加氧酶（CMO）基因分离,并导入水稻中。CMO是合成乙酰-甜菜碱的第一步反应酶基因,携带这种基因的植物有很强的抗旱性。

另外,从冰叶日中花的cDNA文库中分离的肌醇-O-甲基转移酶的基因（Imtl）已经得到克隆[17],可在盐碱或干旱胁迫下诱导表达,其转基因植物对盐害和干旱具有一定的抗性[18]。Hightower（1991）[19]成功地将比目鱼体内的抗冻蛋白（A FP）基因转入番茄,可以在番茄体内稳定转录AFP的mRNA,这种转基因番茄的组织提取液在冰冻条件下能有效地阻止冰晶的增长,转基因植株的抗冻能力明显提高。

目前,已经分离得到的目的基因有 100多个[20],可分为六大类:种子贮存蛋白基因、与光合作用有关的基因、与抗逆性有关的基因、与生长分化有关的基因、生长素合成基因以及其他的如蔗糖合成酶、乙醇脱氢酶、玉米的转座子、一些植物的线粒体、叶绿体基因等。

目的基因获得以后,往往需要经过经体外切割、拼接与重组等修饰后才能利用,引人到受体细胞。为了使目的基因在受体细胞中很好地表达,必须选择适当的启动子,首先要切去原基因的启动子和内含子,然后选用适当的启动子连接到该目的基因上。王关林等[21]成功从枯草芽孢杆菌中克隆果糖聚合酶基因sacB,并将CaMV 35s启动子连接到该基因上,通过农杆菌将其导入番茄,获得了转sacB基因的番茄,通过抗冻试验表明,sacB基因在番茄中很好的表达,赋予转基因番茄良好的抗寒性状。国外研究人员已分离克隆出3个与水稻耐淹能力有关的基因pdcl、pdcll和pdclll,并采用不同的启动子转入水稻基因组中,获得部分转基因植株。[16]张玉秀等成功克隆干旱诱导启动子和重金属诱导启动子,这些启动子的使用可以大大降低能量消耗,使转基因植物在获得抗逆性的同时,又不影响正常的生长发育。[22]

二、外源基因导入植物

将外源基因导入植物受体的方法有多种,从受体角度来看,可归纳为二类:一类是将外源基因导入植物的原生质体或植物的细胞、组织,这种方法受植株再生的限制;另一类是将外源基因直接导入植物体。

1.将外源基因导入原生质体或植物的细胞、组织的方法主要有以下几种

叶盘法:将植物的叶片、子叶、表皮薄壁细胞或其它组织进行人为损伤（如切割）,造成伤口后,放入农杆菌溶液中浸泡一段时间（一般为几分钟）,利用农杆菌介导。把这些浸染过的组织放在适当的培养基上培养,可以再生出转基因植株,这种方法对双子叶植物的适用性较高。以猕猴桃的叶片、下胚轴、茎段为受体,利用农杆菌介导,将 GUS（葡糖苷酸酶）和NPTⅠ（新霉素磷酸转移酶）等外源基因导入猕猴桃获得转基因植株。[23]

聚乙二醇法（PEG）:这种方法常以植物的原生质体作为外源目的基因的受体,将受体细胞的原生质体悬浮在含有目的基因的介质中,由于PEG的处理,促进了原生质体摄取目的基因,从而实现受体细胞的转化。康耐尔大学的研究人员应用PEG介导技术成功将 GUS基因导入水稻原生质体,并得到转化植株。[24]

微注射法:采用微注射法可以将目的基因直接注入受体细胞的原生质体或细胞核、线粒体中,微注射法每次可注射少量受体细胞,但转化率很高。这种方法已经在烟草、油菜等原生质体上获得成功。[25]

电穿孔法:在高电压的外加电场中（一般为1～1.25KV/OM-1处理10毫秒）,植物的原生质体膜上产生可恢复的瞬间通道,外源基因可以通过通道进入原生质体,从而实现细胞转化。用这种方法转化的原生质体已经再生出可孕的转基因玉米和水稻等植株[26]。

超声波法:利用强脉冲超声波的作用,将目的基因导入受体细胞,使其复制表达。上世纪90年代,中国农科院利用此方法成功将目的基因导入烟草[27,28]。

粒子轰击法:将外源DNA包埋在金属微粒中或附于金属微粒表面,在高电压下将金属微粒加速并喷射,使其穿透细胞壁打入受体细胞,这样外源基因即可进入受体细胞,这种方法的转化率较高。美国Christou研究小组应用此方法成功将 GUS基因导入水稻并获得转化植株[24]。

2.外源基因直接导入植物体的方法有以下几种

花粉管通道法:利用开花植物授粉时形成花粉管的特性,通过花粉管直接导入外源DNA,使植物的卵、合子或早期胚胎细胞发生转化,进而实现目的基因的转移。花粉管通道法一般在植物开花几小时至几天时间内导入外源基因,这可根据植物的不同以及温湿度的不同而异。可采取子房注射、浸泡、滴注等方式,也可将外源DNA滴注在去掉柱头的切口处。由于这种方法可以将外源基因直接导入植物体内,转化率高,还不受植株再生的限制,是目前较多采用的方法,而且已经获得棉花、小麦、水稻、番茄、花生、大豆等二十多种转基因植株。[20]

粒子轰击法:这种方法不仅可以应用于外源基因导入原生质体、细胞或组织中,也可用于外源基因直接导入植物体。应用粒子轰击法,可以将水稻的根、叶、雄蕊、胚等器官作为外源基因的受体,由于这些器官或组织容易由体胚发生途径再生植株,可省去原生质体再生这一困难环节。[24]

浸泡法:可以将植物的胚、种子、幼苗等浸泡在含有外源基因的溶液中,这些受体在吸水的同时而将外源DNA带入。一般浸泡时间在2～3天。这种方法操作简单,易于推广。陈启锋等采用浸泡法成功将牛胰DNA导入大麦、玉米、大豆等作物[29]。

注射法:采用注射法同样可以将外源基因导入植物体。王全伟、徐香玲等用注射法将DREB1C基因（652bp）转入大豆获得成功,该基因的编码产物可有效调控植物的耐旱、耐盐等逆境。[30]在水稻孕穗期开花前几天,在其穗颈处下部注射DNA溶液50微升,从而将外源基因导入植物体。[31]

三、转基因细胞的鉴定

为检测外源基因是否已经进入细胞并获得表达,必须对转基因细胞进行鉴定。目前主要采用报告基因检测法。

报告基因检测法是现在常用的鉴定方法,报告基因是检测外源基因导入植物细胞后是否具有功能的一种指示基因,通过检测报告基因的表达,可以了解与其相连的外源基因的表达。目前常用的报告基因如下:

氯霉素乙酰转移酶基因（CA T）,它可使氯霉素转化成3-乙酰氯霉素和1,3-二乙酰氯霉素,从而使氯霉素失活,因此凡是进入植物细胞并抗氯霉素的,既说明外源转基因已经表达。

新霉素磷酸转移酶基因（NPT）,它可以使转化细胞对某些抗生素如庆大霉素、卡那霉素产生抗性,从而使抗生素失活,以此鉴定外源基因在受体中的表达。樊军锋利用叶盘法和基因枪相结合的方法,用双价耐盐基因—1-磷酸甘露醇脱氢酶基因/6-磷酸山梨醇脱氢酶基因—转化秦美猕猴桃,经诱导不定芽及诱导生根阶段卡那霉素连续筛选,获得了卡那霉素抗性转化植株。[32]

荧光素酶基因,这种基因可以合成荧光素酶,该酶在氧化荧光素的过程中发出荧光,可以用荧光器检测到,从而鉴定外源基因的表达。

四、基因工程在提高植物抗逆性的展望

利用基因工程将外源抗逆基因导入植物细胞或植物体,从而提高其抗逆性,具有广阔的发展前景。我国是转基因农产品研究开发的大国,目前转基因植物的种植量位居全球第四。[33]但通过基因工程提高植物抗逆性的研究仍有许多问题亟待解决。植物的抗逆性往往不是由单个基因决定的,而是由多基因控制的数量性状[34],因而对提高植物的抗逆性,尤其对一些属数量性状的,仅仅靠一个外源基因的导入来提高植物抗逆性有一定难度,利用基因组工程转入一系列基因,可综合提高植物的抗逆性,具有广阔前景。[35]更多地筛选具有抗逆性状的目的基因、提高外源基因的转化率、转基因细胞的植株再生、有效解决基因沉默现象、转化植株后代的遗传稳定性、转基因植物的安全等问题,都是基因工程研究所必须解决的。

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Progress in Research of Genetic Engineering Improving Plant Stress Resistance

ZHANG Qi-ming

（College of Biological Engineering,Dalian University,Dalian 116622,China）

Select the target gene which owns stress resistance,transplant into the receptor cells in different ways,make it express itself,thus the plant stress resistance is improved.It is promising to improve plant stress resistance by using genetic engineering.

genetic engineering;plant;stress resistance

Q947

A

1008-388X（2010）01-0057-04

2010-01-10

张启鸣（1987-）,女,山东烟台人。

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