肺鳞癌蛋白质组学研究现状

曾剑 金龙玉 刘建新

肺鳞癌蛋白质组学研究现状

曾剑 金龙玉 刘建新

肺鳞癌的蛋白质组研究是探析肺鳞癌发病机理的重要方法之一，能为肺鳞癌的临床诊断、治疗以及预后判断提供重要信息。目前对肺鳞癌的蛋白质组研究取得了许多成果，本文就此做一综述。

肺癌；鳞状细胞癌；蛋白质组；诊断；预后

肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤之一，其中以鳞癌最为常见，约占全部肺癌例数的30%～50%。随着蛋白质组学技术的发展及其在肺癌研究中的应用，对肺癌的蛋白质组学研究取得了许多重要的成果。肺癌包括多种类型，每种类型的病因、机理及其分子生物学行为均有所不同，须分别予以研究探讨，本文就现阶段肺鳞癌的蛋白质组学研究的现状进行综述。

1 肺鳞癌蛋白质组学及其相关技术

肺鳞癌的蛋白质组学研究是指应用大规模蛋白质分离和鉴定技术，研究肺鳞癌癌细胞在特定时间和空间上表达的基因组编码的全部蛋白质及其组成成分、表达水平和修饰状态，以及蛋白质与蛋白质的相互作用和联系，从蛋白质水平了解肺鳞癌的发生发展机理，诊断、治疗及其预后判断提供客观依据，主要包括结构蛋白质组学和功能蛋白质组学研究。目前研究主要集中在前者，标本大多取自活体肺鳞癌组织、体外培养的肺鳞癌细胞和人体血清。肺鳞癌的蛋白质组学研究技术包括蛋白质分离技术、蛋白质鉴定技术和生物信息学技术。蛋白质分离技术常用的有双向凝胶电泳(twodimensional gel electrophoresis，2-DE)；二维液相色谱(two-dimensional liquid chromatography，2D-LC)、二维毛细管电泳(two-dimensional capillary electrophoresis，2D-CE)、液相色谱—毛细管电泳(liquid chromatographycapillary electrophoresis，LC-CE)等技术，其主流技术是双向凝胶电泳；蛋白质鉴定技术主要有质谱分析法(mass spectrometry,MS),窄pH梯度胶分离以及高灵敏度蛋白质染色技术，其中质谱分析法包括电喷雾质谱技术(electrospray ionization,ESI)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI-TOFMS)，生物信息学是由计算机技术、网络技术和生命科学技术研究发展相互融合而成的一门新学科,主要用于数据的收集、存储、处理、构建、搜索及研发等[1-2]。就目前来看，国外对于肺鳞癌的蛋白质组学研究进行得较少，我国在这方面的研究处于领先。

2 肺鳞癌发病机制与早期诊断的蛋白质组学研究

2.1 活体组织肺鳞癌的蛋白质组学研究

肺鳞癌的发病机制目前仍不是很清楚，从蛋白质组学研究角度，了解到在肺鳞癌的发生发展过程中有一些新蛋白质的出现，也有一些其它正常组织或癌组织中也存在，但在肺鳞癌组织中呈现显著增多或减少的蛋白质，这对于了解肺鳞癌的发病机制以及早期诊断肺鳞癌有很大的帮助。

黄英等[3]对肺鳞癌组织Wnt5a蛋白表达的研究表明，在鳞癌组织中Wnt5a蛋白表达明显升高，Wnt5a蛋白表达与Wnt5a基因有相同趋势，Ⅲ～Ⅳ期较Ⅰ～Ⅱ期增高，且吸烟患者的Wnt5a蛋白表达也较非吸烟患者为高。罗国安等[4]鉴定出了7个仅在肺鳞癌表达的蛋白，包括zinc finger protein 160、complex Ⅰ、MHC class Ⅰ antigen、KIAA1323 protein、ORF protein、CaMK-Ⅱ、gamma subunit；有如下蛋白表达量在肺鳞癌显著增多: MPOC, hemoglobin mutant βchain，hemoglobin β chain，MnSOD，Prx-1，DJ-1，CB，similar to v-ets avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1，Anti TNF-alpha antibody light-chain Fab fragment (2个) ERp29，CGI-145 protein mRNA，hemoglobinβ-subunit variant，immuno globulin kappachain VK-1，ADP-ribosyl cyclase 1，Ig kappa chain N IG2 precursor，CRT，DJ398G3.1，mutantβ-globin；有如下蛋白呈低表达: serumalbumin，a-enolase -1，BiP protein，PD IA1，TPM2，TPM3， Vim，β-actin，Glx I，similar to hypothetical protein FLJ10830，SNAP，HSP27，neuropolypep tide h3，AK1，aldolase A。

SCC-Ag是肿瘤相关抗原(TA24)提纯亚单位，是鳞癌细胞的一种特殊蛋白质，正常组织含量极低[5]。在参与肺鳞癌组研究的患者中阳性率为68.15%，表达水平为3127±2119，表明SCC-Ag可作为肺鳞癌与其它类型肺癌的鉴别诊断指标[6]。

通过对20例人肺鳞癌组织和配对的癌旁正常支气管上皮组织进行蛋白质组学研究，汤参娥等[7]人找到差异蛋白质点76个，对68个差异蛋白质点进行了肽质量指纹图分析，鉴定出一些与瘤基因、细胞周期调控、信号转导等有关的肺鳞癌相关蛋白；研究并发现了肺鳞癌相关蛋白mdm2、c-Jun和表皮生长因子受体(EGFR)在人肺鳞癌组织中高表达，而在正常对照中均表达下调，结论成功鉴定了68个肺鳞癌相关蛋白。

吴晓英等[8]应用脱氧胆酸-三氧醋酸(DOC-TCA)法提纯支气管上皮癌变各阶段组织总蛋白质，比较分析人支气管正常上皮、鳞状化生、典型增生和上皮浸润癌组织各7例的双向凝胶电泳图谱，鉴定出大量与细胞增生、分化和信号传导相关的蛋白质，发现其中TPR repeat-protein 1能与热休克蛋白(hsc70)的c端区域相互作用，抑制某些还原酶的活性；WAP14作为蛋白酶抑制子，它可能是抗击入侵的微生物或调节内源性蛋白水解酶，可能与鳞化后纤毛的防御能力丧失而机体以此代偿有关；Folate receptor2具有调节组织的叶酸平衡及抗肿瘤作用；M-phase phosphoprotein 6对细胞分裂进程有促进作用；hnRNP G与hnRNP B1是同一家族成员，hnRNP B1在不典型增生与早早期肺癌中均过表达；TNF alpha induced protein 1能诱导和抑制多个基因表达，如通过抑制癌基因c-jun表达而发挥抗肿瘤作用。MTAPase参与嘌呤、多苯胺的代谢及与调节转甲基化的活性有关。在上皮浸润性鳞癌组织中表达的N-myc-interactor(Nmi)是Mvc蛋白家族的新成员，此蛋白家族在细胞增生、分化和肿瘤转型方面起着重要作用。在浸润癌组织中两种蛋白RGS-R(Regulator of G-protein signaling 16)和Mitogen-activated protein kinase 10(JNK3)均为重要的信号传导蛋白，其中RGS-R参与EGFR信号传导通路，P53对此种G蛋白信号调节子具有靶向性抑制作用；JNK3除调节信号传导外，还是一种与神经凋亡有关的蛋白激酶。该研究为进一步探讨肺鳞癌癌变机制，筛选肺鳞癌的特异性分子标志物奠定了初步基础。

李萃等[9]的另一项研究结果鉴定出一些共同的肺鳞癌相关蛋白质，如原癌基因c-Jun、上游结合因子、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白质B亚单位样蛋白、Rho相关的GTP结合蛋白RhoQ、mdm2、XEDAR等，发现它们在肺鳞癌发病中具有重要的作用，有可能是鳞癌潜在的分子标志物。密歇根大学医学中心在对16例肺鳞癌研究中发现了52个与其它类型肺癌差异表达的蛋白质点。其中32个蛋白质点已被鉴定。该研究将有利于鉴定肺鳞癌新的早期诊断的分子标志物[10]。

2.2 体外培养肺鳞癌细胞的蛋白质组学研究

体外培养细胞也是用来进行蛋白质组学研究的一种取材，其优点就是细胞纯度高，不存在干扰标本检测的其它组织。但体外培养细胞不足之处在于经过多代培养后，子代细胞可能有蛋白质的变化差异存在，影响研究结果。同时一些分泌蛋白被分泌到细胞外也无法精确测定。

Zhang等[11]选择人肺鳞癌细胞系NCI-H226进行2-DE分析研究，鉴定出28种肺鳞癌蛋白质,并建立了肺鳞癌NCI-H226细胞系的2D数据库，该库由127种蛋白质组成，这是迄今为止最大的肺癌2D蛋白质组数据库之一，对肺鳞癌及其它类型肺癌的进一步研究提供了重要的线索。詹显全等[12]对人肺鳞癌细胞系NCI-H 520双向电泳图谱中的60个蛋白质点进行PMF分析，初步鉴定了44个与细胞周期、细胞信号传导有关的蛋白质。Li等[13]运用血清蛋白质组学分析法对人肺鳞癌细胞系HTB-182进行生物标记物筛选，鉴定出16种差异表达的蛋白质。

2.3 血清肺鳞癌蛋白质组学研究

血清的蛋白质组学研究相对于组织的蛋白质组学研究而言，难度要大。主要原因在于血清中蛋白质丰富，干扰大，存在大量高丰度的蛋白质，而所要研究的目标蛋白质在血清中的丰度可能极低，蛋白质分子量极少，难以检测到，因此血清蛋白质组学研究对仪器设备的要求更高，以前所采用的血清蛋白质组研究方法只能获得一些丰度高的蛋白质，目前最新的、敏感度较高的血清蛋白质组学研究采用的方法主要为SELDI(Surfaced Enhanced Laser Desorption／Ionization)蛋白质芯片技术。它具有快速、简单、敏感、样本用量少等优点[14]。

采用以肿瘤免疫学与蛋白质组学研究技术有机地结合为基础的血清蛋白质组学研究体系(SERPA),李萃等[15]成功鉴定出14个肺鳞癌相关抗原,利用IPG双向电泳分离人肺鳞癌组织及癌旁正常支气管上皮组织的总蛋白质，以识别差异表达的蛋白质；应用质谱仪得到相应的肽质指纹图谱，鉴定出一些瘤基因、细胞周期调控、信号转导等有关的蛋白质，包括α-烯醇酶及其异构体、前B细胞增强因子前体、细胞角蛋白10、二硫化物异构酶ER60前体、ATP合酶β链、磷酸丙糖异构酶及其异构体、磷酸甘油酸变位酶1、果糖二磷酸醛缩酶、膜联蛋白A2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白质β亚单位样蛋白、碳酰还原酶，它们均与肺鳞癌的发生、发展密切相关。

戴嵩玮等[16]验证并鉴定出在肺鳞癌病人血清淀粉样蛋白质SAA高表达，而且随着病程的恶化，SAA的表达水平升高，CYFRA21-1属角蛋白19片段，是非小细胞癌较有价值的血清肿瘤标志物[17-18]，通过对鳞癌患者不同临床分期血清两种细胞角蛋白分子片段(TPS，CYFRA 21-1)及SCC-Ag的检测结果比较可以看出鳞癌患者Ⅲ、Ⅳ期血清TPS，CYFRA 21-1及SCC-Ag水平及阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ期(P＜0.05)，而各期鳞癌患者TPS，CYFRA21-1的检测阳性率均高于SCC-Ag的检测阳性率[19]。赵兵等[20]通过用化学发光法检测发现CYFRA21-1在肺鳞癌中阳性率极高，达84.8%，SCC在肺鳞癌组中阳性率为37%。进一步说明SCC可作为肺鳞癌的鉴别指标，有助于肺癌的病理分型。

聂赣娟等[21]通过对肺鳞癌患者及健康人血清蛋白质组学研究，识别了4条差异蛋白质条带，鉴定了29种非冗余的蛋白质，其中一些蛋白质可能是候选的肺鳞癌血清分子标志物，该研究发现结合珠蛋白-2(HP-2)在肺鳞癌患者血清中的表达水平高于健康人。

3 肺鳞癌预后判断的蛋白质组学研究

蛋白质的差异表达也能对肺鳞癌的预后作一定的判断，即通过检测某种蛋白质的表达增高或减低，来判断肿瘤预后的好坏。这方面也取得了一些重要的成就。如罗国安等[4]鉴定出了24个与肺癌发生有关的蛋白，分别是：髓过氧化物酶异构体(C)A链、锰过氧化物歧化酶A链、Peroxiredoxin 1、人主要组织相容性抗原Ⅰ、组织蛋白酶B、磷酸丙糖异构酶、ADP-ribosyl cylase1、α-烯醇化酶21、β-原肌球蛋白2、Vimentin、β-肌动蛋白、醛酮变位酶Ⅰ、热休克蛋白27、神经肽h3、凝结因子X、Galectin-1、醛缩酶A、MAP kinase 3b、p53相关蛋白、Cyclophilin A、血清白蛋白、BiP protein和血色素蛋白。从目前对肺癌临床检测和疾病愈后来看，Prx-1，CB，α-enolase，ADP-ribosyl cyclase，CRT，TPI，醛缩酶A(aldolase A)，HSP27等可用于肺鳞癌临床诊断指标，其活性上升预示着有不佳的预后。相反，BiP，Glx Ⅰ，MnSOD，TPM活性上升则预示了良好的预后。在对靶蛋白(酶)的寻找上，MAP激酶3b和GlxⅠ值得关注。张廷平等[22]发现在肺鳞癌中，NK细胞和DCs在肿瘤组织中的浸润数量与肿瘤患者的预后呈正相关，可作为判断肺鳞癌预后的指标之一，两者联合检测意义较大，但两者不是影响预后的独立因素。Engel等[23]发现肺鳞癌nm23 mRNA的表达高于癌旁正常组织，低分化癌高于中分化癌，nm23 mRNA高表达病例生存时间短。邹伟等[24]在肺鳞癌研究中还发现，半年内死亡组的p53蛋白阳性表达率明显高于5年以上生存组；半年内死亡组p16蛋白阳性率则明显低于5a以上生存组；nm23蛋白表达与患者预后关系不明显。

4 肺鳞癌蛋白质组学研究的发展前景

蛋白质是基因表达的产物，理论上认为，肺鳞癌细胞发生了多少基因突变，就有多少种肺鳞癌的细胞蛋白质变化。目前对于肺鳞癌蛋白质组学研究其难点仍在于对低丰度蛋白质的提取与鉴定，这主要是对研究设备提出了新的要求。此外，虽然目前在肺鳞癌蛋白质组学研究方面已经鉴定出了不少差异蛋白质，但这些蛋白质相对于肺鳞癌的临床诊断而言其特异性、敏感性有多大，仍有待我们作进一步的研究。研究肺鳞癌的发病机制关键是在于从分子生物学角度进行，随着研究层次的更加精深发展和研究设备的不断更新提升，对肺鳞癌的研究也将越来越广泛。但对于肺鳞癌的总蛋白质的提取仍是一个长期的过程。相信在不久的将来，随着实验技术的进步，对于探索肺鳞癌的分子生物学事件及其发病机制必将变得更加清晰。

[1]蔡丹,陈强,叶韵斌.蛋白质组学技术在肺癌研究中的应用[J].肿瘤学杂志,2007,13(6):496-499.

[2]杨拴盈,南岩东,温雪萍.肺癌蛋白质组学研究的现状与进展[J].国际呼吸杂志,2006,26(6):471-473.

[3]黄英,刘国祥,章波,等.Wnt5a在肺鳞癌和腺癌中的表达及意义[J].重庆医学,2007,36(21):2179-2184.

[4]罗国安,邓斌,叶能胜,等.肺鳞癌和小细胞肺癌组织比较蛋白质组学研究[J].高等学校化学学报,2005,26(9):1645-1649.

[5]Kato H,Torigoe T.Radioimmunoassay for tumor antigen of human cervical squamous cell carcinoma[J].Cancer,1977,40(4):1621-1628.

[6]卞京文.SCC-Ag在肺癌患者血清中表达的临床意义[J].临床肺科杂志,2007,12(11):1210-1211.

[7]汤参娥,李萃,等.人肺鳞癌组织的比较蛋白质组学研究[J].中华肿瘤杂志,2006,28(4):274-278.

[8]吴晓英.人支气管上皮癌变各阶段组织蛋白质双向电泳图谱的差异分析[J].中国癌症杂志,2004,14(3):201-206.

[9]李萃.人肺鳞癌及肺炎性假瘤组织的蛋白质差异表达谱的初步建立[J].中华现代内科学杂志,2006,3(8):841-845.

[10]Oh J M,Brichory F,Puravs E,et al.A database of protein expression in lung cancer[J].Proteomics,2001,1(10):1303-1319.

[11]Zhang H.Protein profile of human lung squamous carcinoma cell line NCI-H226[J].Biomedical and Environmental Science,2007,20(1):24-32.

[12]詹显全,陈主初,关勇军,等.双向凝胶-飞行时间质谱法分析人肺鳞癌细胞NC1-H520和H520蛋白质组成分[J].癌症,2001,20(60):575-582.

[13]Li C,Li X Y,Tang C,et al.Screen biomarkers of human lung squamous carcinoma by serological proteome analysis of HTB-182[J].Transactions of Nonferrous Metals Society of China,2006,16(S2):s839-s844.

[14]何大澄,肖雪媛.SELDI蛋白质芯片技术在蛋白质组学中的应用[J].现代仪器,2002,8(1):l-4.

[15]李萃,肖志强,章晓鹏,等.人肺鳞癌组织的血清蛋白质组学的比较分析[J].中国生物化学与分子生物学报,2005,21(3):357-368.

[16]戴嵩玮.一个在肺癌血清中高表达的标志分子SAA的发现及鉴定[J].中国科学C辑:生命科学,2007,37(2):129-134.

[17]Abbasciano V,Sartori S,Trevisani L,et al.Neuron-specific enolase,thymidine kinase,and tissue polypeptide-specific antigen in diagnosis and response to chemotherapy of small-cell lung cancer[J].Cancer Detect Prev,1999,23(4):309-315.

[18]Boher J M,Pujol J L,Grenier J,et al.Markov model and markers of small cell lung cancer:assessing the influence of reversible serum NSE,CYFRA21-1 and TPS levels on prognosis[J].Br J Cancer,1999,79(9-10):1419-1427.

[19]刘艺,陈铭声.TPS与CYFRA21－1对肺鳞癌临床诊断价值研究[J].山西职工医学院学报,2007,17(3):3-6.

[20]赵兵,张苗苗.血清CEA、NSE、CYFRA21-1和SCC联合检测在肺癌诊断中的临床价值[J].江西医学检验,2007,25(5):441-442.

[21]聂赣娟,李茂玉,张鹏飞.肺鳞癌患者和健康人血清的差异蛋白质组学研究[J].国际病理科学与临床杂志,2007,27(6):470-475.

[22]张延平,张百江.NK细胞及DCs在肺鳞癌组织中的浸润与预后关系的研究[J].实用肿瘤学杂志,2007,21(5):423-426.

[23]Engel M,Theisinger B,Seib T,et al.High levels of nm23-H1 and nm23-H2 mRNA in human squamous-celll lung carcinoma are associated with poor differ- entiation and advanced tumor stages[J].Int J Cancer,1993,55(3):375-379.

[24]邹伟,古宝亮,杨梅怀,等.p53、p16、nm23基因蛋白在肺癌中的表达及意义临床与实验[J].临床与实验病理学杂志,1999,15(3):10-12+98.

The proteome study of lung squamous cell carcinoma (LSCC) is one of the methods to explore the mechanism of LSCC, and can provide much important information for clinical diagnosis、treatment and judging for the prognosis of LSCC. Till now there has much achievementscientific research in this field, here presenting an overview.

lung cancer; squamous cell carcinoma; proteome; diagnosis; prognosis

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.12.020

410013 中南大学湘雅三医院胸外科 (曾剑 金龙玉 刘建新)