化学发光免疫分析技术及其应用研究进展*

魏光伟,余永鹏,魏文康,罗胜军*

(1.广东省前沿动物保健有限公司,广东广州510550;2.广东省农业科学院兽医研究所,广东广州510640)

化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)诞生于1977年,Halman M等[1]根据放射免疫分析的基本原理,将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来,发展出化学发光免疫分析的方法。

CLIA与放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)、荧光免疫分析(fluorescence immunoassay,IFA)及酶联免疫分析(enzyme-linked immunoassay,ELIA)相比,CLIA具有无辐射、标记物有效期长及可实现全自动化等优点,已得到广泛的应用。CLIA具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备等特点,应用范围较广,既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体,又可用于核酸探针的检测[2-3]。CLIA正被越来越多地用于蛋白质、激素、肿瘤、病原微生物、毒物等成分的检测,CLIA技术为兽医学、医学及食品分析检测诊断和科学研究提供了一种痕量或超痕量的非同位素免疫检测手段。

1 化学发光免疫分析基本原理

化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。免疫反应系统是将标记物质标记在抗原或抗体上,经过特异性免疫反应后,形成抗原-抗体复合物。然后进行对标记物进行检测,来测定待检物[2]。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子,利用发光信号测量仪器光量子产率。

1.1 免疫分析原理

免疫分析是利用抗原与抗体特异性结合形成抗原-抗体复合物而建立起来的一种高选择性的分析方法,根据其检测方法可分为非标记免疫分析和标记免疫分析。非标记免疫分析是利用抗原与抗体结合形成抗原-抗体复合物后,其理化性质发生改变,出现肉眼可见的沉淀、凝集等现象,利用这些现象来检测待检物。标记免疫分析是在不影响抗原、抗体生物活性的基础上将标记物质标记在抗原或抗体上,然后进行免疫反应形成抗原-抗体复合物,再对标记物质进行检测,从而间接检测待检物的方法[3]。目前常用的标记物有放射性的125I,非放射性的碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶,镧系稀土元素等。

1.2 化学发光原理

化学发光是化学物质在特定化学反应中产生的光辐射。通过高能中间体的分解在化学反应中激发单态分子的形成,分子被激发后是不稳定的,它要释放出多余的能量而回到基态,其中部分的能量以发光形式释放出来。因此,任何一个化学发光反应包括两个过程:激发和发光过程。一个典型的化学发光过程包括三个基本过程:①化学反应释放足够的能量,此过程存在产能效率φc;②发光物质接收能量,发生化学结构的改变,形成激发态中间体,要求发光物质接收能量的效率比较高(能量传递效率:φe);③激发态中间体通过光的形式释放多余的能量回到基态[4]。激发态回到基态的方式很多,如磷光,放热等,所以激发态中间体的荧光效率φf也需要比较高。整个过程的化学发光效率φcL=φc×φe×φf。

1.3 化学发光免疫分析的原理

化学发光免疫分析法是化学发光和免疫分析结合的产物。它同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高选择性。化学发光免疫分析是用化学发光反应的试剂标记抗原或抗体,标记后的抗原和抗体与待测物经过一系列的免疫反应和理化步骤,最后以测定发光强度形式测定待测物的含量。

2 化学发光免疫分析的分类

化学发光免疫分析根据应用发光体系应用于免疫分析中的方式不同可分为直接标记发光物质的免疫分析,酶催化化学发光免疫分析和电化学发光免疫分析。

2.1 直接标记发光物质的免疫分析

目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。

2.1.1 鲁米诺类标记化学发光免疫分析 Albrechtn阐述了合成分子鲁米诺(luminuo)的化学发光[5]。鲁米诺、异鲁米诺(lsolumino1)及其衍生物是最早在CLIA中使用的一种常用的化学发光物质。

鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中,鲁米诺可被许多氧化剂氧化而发光,其中H 2O2最为常用。但由于鲁米诺氧化发光的反应速度较慢,需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要使用辣根过氧化物酶(H RP),无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。

早期的鲁米诺体系主要用于无机物、有机生物小分子的测定,但由于标记后发光强度降低而使其灵敏度受到影响。20世纪80年代,人们发现发光体系中加入某些酚类及其衍生物、胺类及衍生物及苯基硼酸衍生物对该体系的发光有显著作用,在这些称作增强剂的物质作用下,鲁米诺的发光强度可被提高1 000倍,并且氧化剂与发光剂等单独作用时出现的“本底”发光显著降低,发光时间也得到延长。这些增强剂的使用使得该体系在蛋白、核酸分析领域得到广泛的应用。

2.1.2 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 Simpson报道了吖啶酯用于化学发光免疫分析的初步研究。Weeks首次合成了用于化学发光免疫分析的吖啶酯AE°NHS。由于AE°NHS的热稳定性不是很好,此后人们又相继研究合成了较AE°NHS更稳定的吖啶酯衍生物并应用于CLIA,其中Law S J等合成的吖啶酯DM AE°NHS被证明具有良好的热稳定性和发光性能,Ciba Coming公司的Magic Lite CLIA系列试剂盒,就是采用DMAE°NHS作为发光标记物。

吖啶酯这类化合物只要在H2O2和OH-存在下就能迅速产生化学发光,且有很高的量子产率,如吖啶芳香酯的量子产率可达0.05,吖啶酯作为标记物用于免疫分析,发光体系简单、快速、不需要加入催化剂,且标记效率高、本底低[6]。这些特点引起广大分析诊断工作者的极大兴趣。

目前,应用于免疫分析标记的标记物主要为吖啶酯和吖啶-9-(N-磺酰基)碳酰胺。近十年来,使用吖啶酯作为标记物发展了各种不同分析物的竞争式和非竞争式免疫分析方法。美国拜耳公司诊断产品ACS∶180系列全自动化学发光分析系统即以吖啶酯作为标记,量度AE标记物化学发光反应所产生的光量子数作为基础,灵敏度可达10-15g/mL。

2.2 化学发光酶联免疫分析

从标记免疫分析角度,化学发光酶联免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA),应属酶免疫分析,只是酶反应的底物是发光剂,操作步骤与酶免分析完全相同:以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应,免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光,用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(A LP),它们有各自的发光底物。

HRP有许多发光底物,但最常用的发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA中,使用过氧化物酶标记抗体,进行免疫反应后,利用鲁米诺作为发光底物,在过氧化物酶和起动发光试剂(NaOH和H2 O2)作用下,鲁米诺发光,酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度[7]。Amersham公司Am erliteTM发光酶免分析系统就是利用这一体系专门设计的。但由于此传统的化学发光体系(H RP-H2O2-luminol)为几秒内瞬时闪光、发光强度低、不易测量等缺点。后来,在发光系统中加入增强发光剂,如萤火虫荧光素,含有取代基的酚类化合物[如4-(3-噻吩基)酚类化合物]、萘酚、取代的溴酸化合物、乙酰苯胺类化合物等,以增强发光信号,并在较长的时间内保持稳定,便于重复测量,从而提高分析灵敏度和准确性。

碱性磷酸酶(A LP)分子质量小、稳定性好、活性高、易分离提纯,已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。碱性磷酸酶和1,2-二氧环乙烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的一类化学发光体系[8]。这类体系中具有代表性的是Bronstein等提出的ALP-AMPPD发光体系。在溶液中AMPPD的磷酸酯键很稳定,非酶催化的水解非常慢,在pH 12、0.05 mol/L碳酸钠缓冲溶液中,分解半衰期可达74年,几乎没有试剂本身的发光背景。AMPPD为磷酸酯酶的直接发光底物,可用来检测碱性磷酸酶或抗体、核酸探针及其他配基的结合物。ALP-AMPPD发光体系具有非常高的灵敏度,无论是固相还是液相检测,对标记物A LP的检测限达10 mol～21 mol,是最灵敏的免疫测定方法之一。对AMPPD加以改进,获得具有更好反应动力学和更高灵敏度的新一代产物CSPD和CDP-Star。这些体系已广泛用于各种基因、病原体DNA的鉴定。在临床诊断的商业化试剂中,原美国DPC公司的Immulite system和Bec-kman Coulter公司的ACCESSAutomated Immunoassay System都是采用Dioxetane/ALP/Enhance System。

2.3 电化学发光免疫分析

电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)是指由电化学反应引起的化学发光过程[9]。ECL的反应在电极表面进行,发光底物为三联吡啶钌[Ru(byp)32+],用另一反应物三丙胺(TPA)来激发光反应。在阳极表面,这两种物质可同时失去电子,发生氧化反应。在电极板上二价的Ru(byp)32+迅速被氧化成三价Ru(byp)33+,与此同时TPA也在电极板上被氧化成阳离子自由基(TPA+°),TPA+°自发地释放一个质子而变成非稳定分子(TPA°),将一个电子递给Ru(byp)33+,形成激发态的Ru(byp)32+°。Ru(byp)32+°在衰减的同时发射一个波长为620nm的光子,重新回到基态Ru(byp)32+。这一过程在电极表面反复进行,产生高效、稳定的连续发光,并不断增强[10]。

电化学发光免疫分析(electrochemilum inescence immunoassay)的突出优点是:①标记分子小,可实现多标记,标记物非常稳定。②发光时间长,灵敏度高,例如据LoranelleL报道,用均相电化学发光免疫分析促甲状腺激素(TSH),检测限为0.04 m IU/L。③光信号线性好,动力学范围宽,超过6个数量级。④可重复测量,重现性好。⑤可实现多元检测。⑥可实现均相免疫分析。⑦快速,完成一个样品的分析通常只需18 m in。⑧可实现全自动化。由于电化学发光免疫分析具有优越性,是一种很有发展前途的免疫分析法,日益受到人们的重视。目前已广泛应用于抗原、半抗原及抗体的免疫检测。瑞士罗氏诊断试剂公司与德国Boehringer Mannheim(BM)公司携手合作的Elecsys免疫分析系列商品药盒也是采用钌联吡啶/TPA电化学发光体系。该系统将ECL与链霉亲和素包被磁珠的微粒子技术以及链霉亲和素-生物素放大系统结合起来,形成一种均相免疫分析,检测灵敏度＜1 pmol/mL,线性范围很宽,例如检测促甲状腺激素的灵敏度＜0.005μIU/mL,测定范围高至100μIU/mL。

3 化学发光免疫分析的应用

CLIA不需要外来光源,具有比IFA更高的信噪比,最低可以检测到100个分子,其灵敏度比RIA或EIA高1至2个数量级,检测范围可达6个数量级,自动化程度高,提高了分析方法的精密度。CLIA已经成为一种先进的痕量或超痕量物质检测技术。

3.1 在兽医学上的应用

CLIA在兽医检测诊断研究和应用还是处在初期阶段,国内外的文献报道很少。主要因为CLIA是一项涉及化学、生物和兽医等交叉学科知识的复杂性的研究,制约了CLIA在兽医检测诊断中研究和应用的速度。

CLEIA已经被欧盟列为检测牛海绵样脑病(BSE)的快速检测手段之一,欧盟当局也准备把CLEIA推广为小型反刍动物如绵羊痒病(TSE)等此类疾病的快速检测手段。

Buschm ann A等[11]用BSE的4种快速检测方法(CLEIA、间接ELISA、夹心ELISA和Eestern blot)检测了来自德国的48只绵羊及来自法国的209只绵羊和19只山羊,这些病例都经过确诊试验验证的。CLEIA检测结果与确诊试验非常吻合,而其它3种方法有53只绵羊与确诊试验的结果不符。

G reening G E等用RT-PCR和CLEIA进行了肠道RNA病毒检测试验。他们在RT-PCR过程中加入DIG-dUTP(地高辛标记的脱氧尿苷),把RTPCR产物和生物素标记的肠道病毒特异核酸探针加到用抗生物素蛋白链菌素的微孔板上,然后加入过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,最后用ELISA和CLEIA进行检测。Greening G E发现CLEIA对脊髓灰质炎病毒等肠道病毒具有非常高的灵敏度和特异性,他们认为CLEIA应该被用于环境水样中肠道病毒的监测。

Vidziunaite R等研究建立关于布鲁菌病和野兔热的增强型CLIA方法。经研究他们确定CLIA检测体系的最佳条件:包被抗体的浓度为20μg/mL,配对抗体浓度为200μg/mL。布鲁菌和兔热病检测线性范围分别为10 ng/mL～2 500 ng/mL和1 ng/mL～500 ng/mL。

Zamora BM等[12]用CLIA检测来自德国不同实验室的屠宰猪肉样品中沙门菌,用间接ELISA作为对比方法。检测了超过1 350份样品,CLIA的敏感性和特异性分别为97.3%和95.1%,而间接ELISA的敏感性和特异性分别为96.2%和94.6%。但是用间接ELISA检测脂多糖抗原时,与大肠埃希菌和耶尔森菌存在交叉反应,而这种交叉在用CLIA检测时不存在。Zamora B M认为主要是因为CLIA具有更宽的检测光谱,而获得关于免疫反应更特异性定义的能力。从整体数据上看CLIA与间接ELISA具有较高的相关性。基于研究的结果,Zamora BM认为CLIA可作为屠宰猪肉中沙门菌抗体检测的参考方法。Zamora BM等也用间接ELISA和CLIA检测鸡场中肠炎沙门菌,以建立一个监测鸡场中肠炎沙门菌感染的一个血清学检测体系。研究认为,间接ELISA和CLIA可用于监测没有免疫过肠炎沙门菌的鸡群的肠炎沙门菌的感染。

Singh A K用ELISA和液相CLEIA检测采集的猪和猫的血清样本中弓形虫的IgG(Toxop lasma IgG,T-IgG)。液相CLEIA对来自猪和猫的临床样品和加料样本都可以灵敏地检测出样本中的TIgG,而ELISA对猫的临床样本中T-IgG不能灵敏地检测出。

Falkenberg U等[13]用化学发光免疫检测方法检测围产期的经产奶牛的不同的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的浓度,来评价其与繁殖性能的关系。研究选用了417头黑白花奶牛。血清样品分别在围产期0、4、10、20、40 d采集。IGF-1的浓度范围为围产期12 h的57 ng/mL±18.9 ng/mL到围产期40 d的74 ng/mL±19.9 ng/mL。研究发现,IGF-1的检测结果和奶牛怀孕的天数显著相关,同时他们还发现血清IGR-1浓度与奶牛的奶产量也成显著相关。由此研究者认为,利用化学发光免疫检测技术检测围产期奶牛的血清IGF-1浓度可以很好的预测奶牛场个体奶牛的繁殖性能。

Hu D等[14]报道一种检测猪胸膜炎肺炎放线杆菌的ApxⅣ抗体的AuC l(4)-增强型化学发光免疫分析方法(CLIA)。A uCl(4)-是金颗粒标记的兔抗猪抗体的不溶性产物,作为测定ApxⅣ抗体的化学发光分析的分析物。5.0×10-2mol的HCl、1.5×10-2mol的NaCl和2.5×10-4mol的Br2时金的溶出度最高。通过临床样品检测发现,ApxⅣ抗体的CLIA与ELISA和IHA相比具有更高的灵敏度,更好的稳定性和更好的实际应用价值,为检测猪血清样品中ApxⅣ抗体提供了一种新的检测方法,可用于大规模样品的筛选。

3.2 在医学上的应用

相对于兽医领域来讲,CLIA已广泛应用到基础和临床医学的各个领域,成为替代RIA的首选技术。

Amersham公司针对AmerliteT M发光增强酶免分析系统研制出的试剂盒项目有甲状腺功能检测的促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素,与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮,以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。Amersham公司虽然研制出这10余种试剂盒,但因操作不够简便,检测项目仅限于蛋白质类大分子化合物,未能广泛应用于临床医学检测。

美国Ciba Corning公司研制的ACS∶180自动CLIA系统能非常精确测量闪光。经过不断的改进,实现了ACS∶180CLIA系统的全自动化,推出全新产品“ADVIA系列”。现有检测项目47项,主要有甲状腺系统:总及游离T3、总及游离T4、促甲状腺素、超敏促甲状腺素、T3摄取量;性腺系统:绒毛膜促性腺激素、泌乳素、雌二醇、雌三醇、促卵泡素、促黄体素、孕酮、睾酮;血液系统:维生素B12、叶酸、铁蛋白;肿瘤标记物:AFP、CEA、CA 15-3、CA 125、CA 19-9、β2微球蛋白、PSA;心血管系统:肌红蛋白、肌钙蛋白T、肌酸激酶-MB;血药浓度:地高辛、苯巴比妥、茶碱、万古霉素、庆大霉素、洋地黄、马可西平;其他:免疫球蛋白E、血清皮质醇、尿皮质醇、尿游离脱氧吡啶。

Thorpe等报道,金刚烷衍生物在碱性磷酸酶作用下可发出高强度的辉光,光信号可持续1 h～2 h。随后国外生产厂家研制出以碱性磷酸酶为标记物的试剂盒,与之相匹配的有DPC的IMMULITE全自动CLIA系统和Beckman的ACCESS全自动微粒子CLIA系统。IMMULITE全自动CLIA系统可检测项目有:心脏病检测、甲状腺功能检测、性腺激素检测、传染病检测、药物检测、血清学检测、血液病检测、成瘾药物检测、糖尿病检测、过敏检测和肿瘤标志物检测。ACCESS全自动微粒子CLIA系统可检测项目主要有:甲状腺功能:总及游离T3、总及游离T4、促甲状腺素、超敏促甲状腺素、T3摄取量;血液系统:铁蛋白、叶酸盐、维生素B12;变态反应:总IgE;内分泌激素:β-HCG、LH、FSH、E2、PT、PRL、皮质醇(Cortisol);药物检测:茶碱、地高辛;肿瘤因子:CEA、AFP、PSA;心血管系统检查:肌钙蛋白I、肌红蛋白;糖尿病检查:胰岛素。

目前商品化的ECL分析系统只有Roche公司的ECL全自动分析系统。主要特点是本底信号极微,特异性更高,最小检出值可小于1 pmol,操作十分简便快速,是CLIA优点较为集中的完美分析技术。

3.3 在食品分析上的应用

Lin S等[15]建立CLEIA检测鸡肉中的氯霉素(CAP)的含量。检测的极限是6 ng/mL。与ELISA相比,此CLEIA方法检测鸡肉中CAP的灵敏度是其10倍。当鸡肉中CAP的含量达到0.05μg/kg～5μg/kg时,CLEIA检测值得回归为97%～118%,变异系数(CV%)为6%～22%。在做相关对比试验时,CLEIA检测结果与气相色谱微孔板电子捕获检测结果相关性非常高。Zhang S等[16]认为此方法非常适合鸡肉样品中CAP的筛查。

Liang P等报道采用ECL来对牛奶中β-内酰胺类抗生素以及β-内酰胺酶进行了成功的检测。Pang Y Q等[17]也采用ECL来进行蜂产品中四环素类抗生素残留的测定,方法是将三联吡啶钌(Ru(bpy)32+)和三丙胺(TPA)维持在电压1.05 V、pH 8.0的碳酸盐缓冲液,用来检测四环素和土霉素,检测限分别为4.0 ng/mL和3.8 ng/mL,结果表明,这种方法的灵敏度高于所报道的绝大多数方法。

MagliuloM等[18]建立了一个用来检测牛奶中的黄曲霉毒素M(1)的快速和超灵敏的CLEIA的分析方法。黄曲霉毒素M(1)标准的基质是以牛奶为基础而配制的缓冲液,牛奶样品检测时不需要任何处理。本方法定量的极限为1 ppt,批内和批间的精密性非常好,变异系数(CV%)都小于9%,回收率的范围为96%～122%。本方法具有非常高的特异性,与其他的黄曲霉毒素不存在明显的交叉反应。检测了24份牛奶样品,CLEIA与HPLC具有很好的相关性(y=0.98x+1.71,r2=0.98,n=24)Magliu lo M认为与以前建立免疫分析方法比较,CLEIA非常用于大量牛奶样品准确灵敏的和高通量筛查黄曲霉毒素M(1),减少检测的成本,提高检测能力。

Rivera V R等[18]建立一个ECL分析方法,用于检测人血清、未稀释人尿和某些食品(全牛奶、苹果汁、生牛肉、馅饼和生鸡蛋)中的肉毒梭菌毒素A、B、E和F。不同类型的肉毒梭菌毒素的灵敏度,A和E型的灵敏度为50 pg/mL,B型的灵敏度为100 pg/mL,而F型为400 pg/mL。A型的最低检测浓度为50 pg/mL,而B、E和F的最低浓度为50 pg/mL～100 pg/mL。本系统与其他类型的肉毒梭菌毒素不存在交叉反应。本方法检测极限与金标准小鼠生物监测的水平相当,但是大大减少了测量时间。Rivera V R认为此快速和灵敏的免疫分析方法在临床医学、科学研究和食品中的肉毒梭菌毒素筛查有非常广的用途。

Yang M等[19]利用ECL(增强型化学发光免疫检测技术)技术、纳米碳管(CNT)和电荷耦合器件(CCD)开发出了一种新型的检测食品中葡萄球菌肠毒素B(SEB)的化学发光免疫检测技术。抗SEB一抗被固定到CNT表面,抗体-纳米管混合物被固定在聚碳酸酯表面,然后进行ECL检测,测出SEB的浓度。研究人员检测了缓冲液、豆浆、苹果汁和婴儿食品等样品,同时与荧光检测法进行了对比。结果表明,灵敏度要远远优于传统的ECL,达到了1 ng/mL。研究人员认为此检测方法具有简单、通用性高和检测成本较低的特点。

4 展望

目前,兽医学诊断方法仍主要局限于传统的血清学方法,费时费力,难以适应兽医快速诊断的形势。国外陆续报道了化学发光免疫技术、化学发光酶免疫技术及电化学发光免疫技术等先进技术,这些方法都有更加广泛的应用前景,一旦方法成熟,它们的高灵敏度、高特异性将使兽医检测诊断的分析方法产生质的飞跃。

食品分析检测的手段主要为毛细管气相色谱和高效液相色谱及其联用技术。现行标准的食品测定需要使用昂贵的大型分析仪器,而且需要通过有机溶剂提取、净化,前处理费时费力,无法进行随时随地的快速检测。本文报道的关于CLIA的一些检测技术,仍然处于摸索阶段,其应用及推广仍有待于进一步努力。

目前,化学发光免疫分析技术在医学的临床应用已非常成熟,有取代放射免疫分析技术和酶联免疫分析技术成为诊断市场上的主流产品的趋势。国外的化学发光免疫分析检测系统价格昂贵,难以得到普及;国内的化学发光免疫分析检测系统虽然价格较国外产品便宜很多,但是灵敏度和检测的可靠性得不到保证。研究者在如何提高免疫诊断的敏感性和特异性、发展新的分析体系和检测技术便携化等方面仍需要不断努力。

CLIA分析方法灵敏度高、特异性强,方法多样,广泛地用于抗原、抗体和半抗原的免疫测定,其线性范围也较宽,符合生物医学和食品安全快速检测的需要,为生物医学和食品安全提供了一种超痕量的非同位素免疫检测手段。随着纳米磁性粒子技术、新型免疫反应增强剂和发光剂的研究开发,流动注射化学发光免疫分析法(FI-CLIA)、毛细管电泳化学发光免疫分析法(CE-CLIA)、高效液相色谱化学发光免疫分析法(HPLC-CLIA)不断开发和完善,CLIA在兽医学、医学、食品分析等方面将会有更广阔的应用前景。

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