基因疫苗的发展及其展望

刘斌忠 锡林郭勒职业学院 草原生态与畜牧兽医系 026000

基因疫苗,也称DNA疫苗、核酸疫苗，其作用机理是将含有可表达的病原微生物的抗原基因整合到某种适宜的质粒DNA中，然后将这种质粒DNA直接注射到动物体内，使抗原基因利用动物细胞进行内源性表达，从而诱发机体产生特异性免疫反应，形成针对病原微生物的免疫保护作用。

1 基因疫苗的优缺点

目前生产上普遍使用的疫苗仍然是传统的灭活疫苗。这是因为灭活疫苗安全，易随时制备，但其病毒抗原不能在体内增殖，故接种剂量大，免疫时间短，且诱发细胞的免疫作用不强。而弱毒疫苗则具有相当的优势，能在动物体内进行有限的增殖，用量小，成本低，适宜作大量的动物免疫接种，且能诱导细胞免疫，使机体产生强而持久的免疫保护力，但存在毒力不稳定的问题，实践证明有时弱毒疫苗能够构成传染源，引起疫病流行。由于已有的疫苗存在不少缺点，因此人们一直希望能找到一种更为理想的疫苗。基因疫苗既具有灭活疫苗的安全性，又具有弱毒疫苗的高效性，故很快便在各种疫苗中脱颖而出，倍受广大研究者的青睐。

2 基因疫苗存在的问题

2.1 接种方式目前已知的接种方法有两类

一是利用基因枪将质粒DNA直接注入皮下、腹膜内及骨骼肌等组织；

二是利用高压放电作用，将质粒DNA涂布于金颗粒上，再通过基因枪将其射入相应的组织与器官。而对规模化、集约化的养殖场而言，这两种方法显然都不太适宜，最好能够研制出相应的口服疫苗或气雾性疫苗，这样在接种时就方便简单、省时、省力。

2.2 接种剂量

基因疫苗同其他疫苗一样，接种量少，抗原基因表达和提呈的抗原蛋白就少；接种量大，抗原基因表达和提呈的抗原蛋白就多。又因为其能够持久表达，因此很可能会产生各种免疫副作用，如免疫耐受、自身免疫、免疫变态反应等。

2.3 接种途径Fynan用50～300微克的含甲型流感病毒的HA基因的纯化DNA接种2次后,用致死量的同一病毒毒株进行致毒,结果表明经肌注、静脉注射以及粘膜免疫的鸡，其保护率分别为25%～36%、24%、30%。由此可见，不同的组织细胞摄取质粒的能力不同，不同细胞的传染效率和表达外源性基因的能力也存在着差异。

2.4 基因疫苗载体的选择---质粒DNA应不具有传染性,在体细胞内不能复制,不可整合到细胞的染色质上,但必须能在相应的细菌中高效率地扩增和使其携带的外源基因能高效率地表达抗原蛋白,以诱导产生强而持久的免疫保护力。

3 基因疫苗的免疫机制

随着基因疫苗的诞生，国内外学者对其免疫机制也进行了许多研究，但由于研究时间短，故对其具体机制尚不清楚。目前主要有以下两种观点：

3.1 利用基因枪经皮肤或粘膜接种后,认为在表皮细胞内有专职抗原提呈细胞APC（酸性磷酸酶）如朗罕氏细胞等参与活化机体免疫的过程。

3.2 经肌肉接种后，DOE.B等首次证实骨骼来源的APC可将表达的抗原提呈给T细胞，诱导出相应的CTL（抗肿瘤细胞毒T淋巴细胞）反应。

4 基因疫苗的安全性评估

基因疫苗受到了广大研究者的关注，同时对于其使用安全性也进行了一系列的研究，目前主要关心的问题有：

4.1 引起免疫功能紊乱的可能性基因疫苗能在动物机体内持久地表达抗原蛋白,从理论上来说，很可能导致免疫耐受、自身免疫、超免疫性等免疫病理现象的发生。但至今在性成熟动物中尚未有相关的报道，而在初生动物，Mor.G等将含疟疾环状子孢子蛋白基因接种2-5天的小鼠，产生了特异的免疫耐受状态；Wang.Y等将狂犬病毒糖蛋白基因接种出生24小时的小鼠却诱导出了较强的免疫应答。由此可见，动物机体免疫系统的功能状态，质粒及抗原的选择与接种后产生的免疫效果有一定的关系。因此为了尽量避免产生免疫病理现象，应考虑选择合适的抗原和载体质粒DNA以及动物的接种龄期。

4.2 外源基因随机整合的可能性质粒DNA及其携带的外源基因进入宿主细胞后，很可能与细胞内的遗传物质随机整合，从而致癌。但已有的研究表明，整合的可能性极小。首先基因疫苗注射时，接种量相当小，故整合的几率微乎其微；其次Nichols.W等直接利用PCR（聚合酶链反应）方法检测肌肉接种后细胞中的质粒DNA，未发现整合。Istwan.D等经实验证实质粒DNA进入细胞后并不复制。另外，畜禽生产周期短，因整合而带来的危害性更小，甚至可以不予考虑。

4.3 抗DNA抗体产生的可能性曾有报道,在人的自身免疫病(如全身红斑狼疮)曾发现了抗体DNA，故许多人担心使用基因疫苗后，可能会产生抗DNA的抗体。Psetsky.Y认为利用细菌DNA免疫接种，可以产生抗哺乳动物ssDNA（变性DNA）抗体，但不产生抗哺乳动物dsDNA（成双碱基对的DNA）抗体。Xiang.Q等则在实验中根本没有检测到抗DNA的抗体。一般来说，能够作为免疫原的DNA必须具备复杂的结构和较大的分子量，故在制备质粒DNA疫苗时，应考虑所用质粒DNA的结构、分子量的大小及核苷酸的序列等因素。当然为了确诊基因免疫后能否真正产生抗DNA的抗体，还有待更进一步的研究。

5 基因疫苗的接种方案和途径

5.1 接种方案。DNA疫苗接种的普通方案是连续注射多次,间隔2-3周,但这种接种方案是可改进的。实验证明，将DNA疫苗与蛋白质疫苗交替注射有可能获得更好的免疫效果。例如给猴子接种HIV-I DNA疫苗以后，再用重组HIV-1（人免疫缺陷病毒I型）的Env（株外膜）蛋白作两次加强注射，结果诱导很好的B细胞和T细胞免疫反应。又例如在结核杆菌DNA疫苗的研究中，如果预先给动物接卡介苗，再注射DNA疫苗作为加强剂，对预防原发性结核杆菌复燃会更有效。

5.2 接种途径。范泓然在1999年发现,DNA疫苗可以通过毛孔进入皮下组织,使小鼠体内产生抗乙肝病毒表面抗原的特异性抗体,其效果可以和通常所用的肌肉注射相媲美。

6 基因疫苗和基因免疫的意义和应用

6.1 在理论方面,基因疫苗和基因免疫开创了免疫学的新领域，提出了一个全新的概念，成为当前研究的热点，是最具挑战性的研究方面。随着基因免疫研究的深入，人们将能够了解病原体与疾病免疫的确切关系，知道一种病原体各种成份诱发了何种免疫成份的产生。同时有助于更好地理解效应免疫的机制。在实际应用方面，基因疫苗也有重要的意义。①基因疫苗的第三次革命。这种第三代疫苗将为预防传染性疾病和肿瘤的基因治疗等开辟了新的道路。它使疫苗的制备更加科学合理，通过研究可以知道哪些基因应当包括进DNA疫苗，筛选出能够诱导出保护性免疫的抗原成份。②利用基因免疫研究单个蛋白质诱导特异免疫反应。分离或合成某个蛋白质的基因，制备出基因疫苗，研究其初次免疫应答的机制。③基因免疫是生产单克隆抗体的有用技术。先分离相应的基因，构建真核表达载体、免疫后得到抗体。

6.2 基因疫苗研究的主要应用：①复杂微生物、寄生虫免疫的制备。如结核杆菌疟原虫的抗原成份复杂，难以纯化。通过扩增有效抗原成分相对应原基因片段，就要简单得多。②易于变异的微生物，特别是病毒疫苗的制备，如HBV（乙型肝炎病毒）、HCV（丙型肝炎病毒），流感病毒。③制备难以培养或危险的微生物疫苗，如HIV （人类免疫缺陷病毒），HDV（丁型肝炎病毒）。④持续病毒感染的预防：LCMV（淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒）、HSV（单纯疱疹病毒）。⑤新生儿、儿童免疫接种。⑥胞内寄生清除，肿瘤免疫的有效途径。由于基因疫苗能够有效刺激CTL（细胞毒性T淋巴细胞）产生，所以在细胞免疫方面有重要意义。

7 基因疫苗的国内外研究概况及展望

自基因疫苗问世以来，国内外学者便对其免疫机制、免疫效果、接种方式、使用剂量、安全性及目的基因表达调控等进行了广泛而卓有成效的研究。在人医方面，爱滋病、人免疫缺陷性病毒及T淋巴瘤的基因疫苗已进入了临床应用阶段，流感病毒、结核病、乙型肝炎、丙型肝炎、乳腺癌、肺癌、狂犬病等的基因疫苗也正处于研究之中。在兽医方面，国外已有关于禽流感和新城疫的基因疫苗的报道。在我国，李建伟等报道了基因免疫诱导鸡对MDV（马立克氏病毒）的保护性反应。哈尔滨兽医研究所的陈化兰等报道了基因免疫可诱导SPF（无物定病原）鸡抵抗禽流感病毒感染，这些工作为我国畜禽基因疫苗的研究作出了有益的探索。

基因疫苗与其它新技术疫苗相比具有很多优越性，尤其对于养禽业来说更具有实际意义。众所周知，很多传染病的病原具有多个血清型或变异株，例如，一旦爆发IBD（鸡传染性法氏囊）或AI（禽流感），我们就可以迅速分离病原，克隆其免疫基因，制备针对该病原型的基因疫苗，因而对防治该病更具有针对性。由于常规的基因克隆技术已经可以在一般实验室开展，从某种疾病的爆发到疫苗的制备仅需1-2天即可完成，从这个角度看对基因疫苗的研究应该投入更多的精力。然而，目前对于基因疫苗的研究还相当有限，尤其是在兽医方面，可以说才刚刚起步。有关基因疫苗的质粒选择，与目的基因调控有关的启动子、增强子、内含子和免疫佐剂等的选择，多个目的基因克隆进同一载体后是否产生干扰现象，以及经不同途径接种后引起的免疫效果和免疫机制机理等许多问题还有待解决，而一旦这些问题得到了成功的解决，那么就可以设计研制出大量理想的基因疫苗，为养禽业的稳定发展作出不可估量的贡献。

[1]Curtiss R I,Cardineau CA·O ral immunization by transgenic plants 〔J〕·W orld Plant Application,1990,90：107-111

[2]董伟,易自力·转基因植物口服疫苗研究进展〔J〕·动物医学进展·2005,26(6)：6-8

[3]任雪艳,陈创夫等·转基因植物基因工程疫苗的研究进展〔J〕·草食家畜(季刊),2004：125·

[4]葛莘·高级植物分子生物学〔M〕·北京：科学出版社,2004：93-95·

[5]黄复深,袁鑫,邱元·植物基因工程疫苗研究进展〔J〕·湖南农业大学学报 (自然科学版)·2008,34(2)：215-220·

[6]闫桂琴·生命科学技术概论〔M〕·北京：科学出版社,2003：88-91·

[7]田佳,贾会勇,李杰·植物可食疫苗研究现状与展望〔J〕·中国生物制品学杂志,2008,21(7)：637-640

[8]刘一萍,邵中军,徐德忠,等.HBsAg阳性孕妇及其新生儿用HBIG对乙型肝炎病毒母婴传播的阻断效果观察[J].疾病控制杂志,2004,8(2)：109-111.

[9]王克恭.基因免疫—传染病防治研究的新热点[J].畜牧与饲料科学，1998，19（2）：45-47