粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与创面愈合

郭敏(综述)黄宏,徐祥 (审校)

(1.重庆医科大学第二附属医院创伤烧伤科,重庆 400010;2.第三军医大学第三附属医院野战外科研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042)

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子是一种多功能的造血生长因子。1977年由Burgess等在鼠的肺条件培养液中首次发现,因具有刺激造血前体细胞形成粒细胞或巨噬细胞集落的功能而得名[1]。1985年,人类重组GM-CSF基因(Recombinant human GM-CSF,rhGM-CSF)被首次克隆表达[2],随后重组人GM-CSF(Recombinant human GM-CSF,rh-GM-CSF)逐渐应用于临床。由于GM-CSF能够促进造血前体细胞的增殖、分化和成熟,并且能够增强淋巴细胞、巨噬细胞的细胞毒作用[3-5],具有促进恢复骨髓造血和增强机体免疫功能的生物学作用,因此,目前GM-CSF主要用于改善放、化疗严重感染等原因导致的骨髓抑制、中性粒细胞减少症以及作为佐剂增强疫苗的免疫原性等[6],以及用于抗病毒、抗真菌治疗等,均取得了很好的疗效。此外,由于GM-CSF能作用于角化细胞、内皮细胞、成纤维细胞和粘膜细胞等,具有促进这些修复效应细胞增殖、分化和迁移[29,49],因此,目前GM-CSF在创面愈合中的作用也受到国内外学者的关注。有研究表明,GM-CSF可以明显促进皮肤伤口愈合,其主要是通过促进炎症反应、炎性细胞募集,促进角化上皮细胞增殖以及促进局部新生血管形成等机制发挥作用[33,47,45]。为此,我们将对GM-CSF生物学活性及其在创面愈合中的作用做一综述。

1 GM-CSF的一般特性

GM-CSF是一种相对分子质量位于15000～35000的多功能细胞因子。人GM-CSF(hGM-CSF)基因全长约2.5kb,含有4个外显子和3个内含子,在核苷酸水平与鼠有70%的同源性,GM-CSF的开放阅读框全长 432bp,编码 144个氨基酸,hGMCSF初产物是一个由144个氨基酸组成的多肽片段,从其氨基末端切除一个17个氨基酸的片段后,由127个氨基组成的多肽蛋白即为成熟的GMCSF[10],它具有 2个N-糖基化位点和 3个O-糖基化位点的糖蛋白,含四个半胱氨酸组成的2个二硫键,分子量从14.5-32kd不等的9条蛋白质带组成,糖基化程度的差别造成分子量不同。编码人类GM-CSF的基因位于5号染色体5q21-5q32[7]。

鼠和人GM-CSF通过与靶细胞膜上的受体(hGM-CSF receptor,hGM-CSFR)结合,发挥其多种生理作用。机体有多种细胞存在GM-CSF受体,如粒细胞、红细胞、巨核细胞等的前体细胞、成熟的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、浆细胞、成纤维细胞、角质细胞、内皮细胞等[12-14]。人和小鼠GM-CSF受体均由α、β两条链组成[10],其中α链是连接亚单位,负责和配体部分的结合,而β链主要和信号转导有关,其细胞内结构是多种信号传导途径的关键。单独α链与配体的结合为低亲合力,β链单独不结合配体,但与α链共同组成高亲和力受体,在信号转导中起主要作用。

GM-CSF属于糖蛋白因子家族,主要由活化的T细胞、树突状细胞、巨噬细胞、角质细胞、内皮细胞和成纤维细胞等分泌,并可通过自分泌和旁分泌方式作用于这些细胞,影响其趋化、增殖和成熟[11,12]。在正常状况下,血循环中GM-CSF的浓度极低甚至难以检测到,但在 LPS等物质的刺激下,其浓度可显著升高[8]。创面上的GM-CSF来源于上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞以及炎症细胞(如PMN和Mφ),通过自分泌作用并作用于这些细胞[9]。

2 GM-CSF的生物学活性

①GM-CSF是一种糖蛋白,不仅能刺激造血祖细胞增殖、分化和成熟并从骨髓向外周转移,而且在体外可以被用于刺激粒细胞和巨噬细胞集落形成,促进巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞及其他单核细胞的生成和分化,在细胞因子网络中占有重要地位。rhGM-CSF在临床上已经被用于骨髓抑制患者(肿瘤放疗、造血干细胞移植后等)促进骨髓细胞的恢复[7]。②GM-CSF参与动员骨髓细胞释放,参与免疫炎症反应和损伤组织器官修复。③GM-CSF在免疫反应中能促进体液免疫及细胞免疫的建立,因此,目前它作为DNA疫苗免疫佐剂已被大量应用;近年来GM-CSF作为肿瘤疫苗和细胞疫苗的免疫佐剂发挥抗肿瘤作用,在临床肿瘤治疗方面已有应用报道[15]。人们开始考虑应用GM-CSF作为一种免疫佐剂以及将其作为免疫基因治疗途径的一部分来研究。④GM-CSF可通过提高免疫细胞的吞噬活性来杀灭病原体。可以刺激嗜酸性粒细胞的功能,提高NK细胞的活动能力,以及诱导单核细胞产生IFN-γ,IL-12和IL-15[16]。另外,GM-CSF可以作为中性粒细胞和巨噬细胞的趋化因子,调节其分化、增殖,并活化其功能。⑤GM-CSF还能作为有丝分裂原促进角化细胞、内皮细胞以及成纤维细胞分离增殖,并且具有促进角化细胞和内皮细胞迁移的功能[17-20]。

3 GM-CSF在创面愈合中的作用

创伤愈合与组织修复的基本病理生理过程分为:局部炎症反应期、细胞增殖分化及肉芽组织形成期(即增生期)和组织重建塑形期(塑形期)三个阶段。炎症反应期是伤后即刻至伤后第3天或6天,增生期是伤后第4天开始至伤后14天,这期主要有再上皮化发生、血管生成及暂时基质形成,塑形期是伤后第8天即开始至伤后1年。各阶段之间并无截然的分界线,彼此有别而又相互重叠。创伤刺激可上调创面GM-CSF的表达[18],GM-CSF作为一种有丝分裂剂和免疫增强剂[21,22],成为创面愈合过程的启动因子[24],可作用于创面愈合必经的每个阶段而发挥着重要作用,促进创面愈合。

3.1 GM-CSF与止血期

创伤愈合始于创伤后止血过程。组织损伤后经外源、内源两条途径立即激活凝血过程,同时释放血管活性和化学趋化性介质,引起一系列血管和细胞的活动。最初由于血管损伤,基底膜暴露,血小板被激活、聚集,其表面膜与凝血通路的许多成分相互作用,加速了血液凝固。很快凝血酶形成加速,纤维蛋白析出,血凝块形成。在激活、聚集的同时,血小板分泌释放多种活性物质,启动和驱使整个愈合过程。Kaplan G发现注射GM-CSF处取活检时创面的止血速度加快[20];2007年的研究显示:GM-CSF可与PAF共同促进血液中组织因子(TF)的主要产生者嗜酸性粒细胞对TF的转录和释放,参与止血[23]。由此可见,GM-CSF在加速止血的同时可能对创面愈合也产生促进作用。

3.2 GM-CSF与炎症期

创伤愈合的炎症反应期是创面修复的初始阶段,其效应将强烈影响着组织增生期和塑形期后两个阶段并对修复结局产生重要影响。事实上,免疫炎症反应贯穿了整个愈合过程,直到瘢痕组织的过度增生也与免疫反应有着密切的联系。研究证实,GM-CSF不仅可以通过自分泌的方式来促进皮肤修复细胞的增殖,而且可以通过自身或介导其他细胞因子来发挥其促进创面愈合作用,增强吞噬细胞清除创面坏死物质、细胞碎片及有害微生物的能力[24-29]。

炎症期局部组织可杀灭侵入的微生物及自身伤亡细胞、坏死组织,防止感染及损伤的扩大,参与炎症的细胞以中性粒细胞和巨噬细胞为主,炎症细胞分泌多种细胞因子诱导修复细胞的迁徙增殖,启动并调控创面修复过程。中性粒细胞是最先到达损伤部位的免疫细胞,通常伤后24小时在局部达到峰值。中性粒细胞的主要功能是吞噬、杀菌以及发挥清创和抗感染作用,而不直接参与创面的愈合过程。通常巨噬细胞来源于外周血中的单核细胞,在伤后第1天开始增加,随后数量逐渐增多,伤后2～4天数量最多,伤后第3天基本完全取代PMN成为创面最主要的免疫细胞。伤后第7天达到肉芽组织中细胞总数的80%以上,成为创面中数量最多、停留时间最长的一种炎症细胞。巨噬细胞除了通过吞噬作用、分泌一些酶以及产生活性基团如:NO、O+2和H2O2等,清除损伤细胞、变性坏死组织和异物,杀灭细菌,发挥清创作用外;更主要它具有强大的分泌功能,合成释放多种细胞因子和生长因子等生物活性物质,趋化修复细胞,刺激成纤维细胞的有丝分裂和新生血管的形成,以促进肉芽形成,在创面愈合中承担重要角色。

GM-CSF具有对参与创面愈合的许多细胞都有较强的化学趋化作用,如朗罕氏细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、成纤维细胞和内皮细胞。因此,在炎症反应期创面GM-CSF能通过加强趋化中性粒细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞至创面,增加创面炎症细胞浸润数量,同时,它还能促进中性粒细胞和巨噬细胞的增殖和活化来提高其吞噬活性和杀菌能力,促进其氧化代谢,增强其表面Fc受体数目,最终提高其吞噬和分泌能力。GM-CSF具有增强中性粒细胞和巨噬细胞对坏死组织、失活细胞碎片、病菌异物的吞噬以及对弹性蛋白酶、胶原酶、活性氧等的分泌,加速局部坏死组织的脱落及对入侵细菌的防御力,促进机体的自溶性清创,提高局部免疫力以抗感染[26-29];另一方面,GM-CSF能促进巨噬细胞合成分泌有利于创面愈合的细胞因子和生长因子,如PDGF 、FGF、EGF、VEGF、IL-6、TGF-β、TNF-α、MCP-1、MIP-1a等,加速创面愈合[4,28,30]。

Smith等在鼠皮下注射GM-CSF发现其能显著地增加巨噬细胞浸润和成纤维细胞增殖,有效地模拟急性创面炎症期反应[31];M.Robson等在SD大鼠急慢性感染创面表面局部应用GM-CSF后,发现其能显著降低由于细菌感染而引起创面收缩抑制的影响,加速创面闭合,局部组织活检行细菌菌落计数较治疗前明显减少[32];Y.Fang等在GM-CSF基因敲出小鼠的全层皮肤损伤模型研究中发现GMCSF基因敲出小鼠创口闭合率、愈合速度、再上皮化程度以及新生血管密度均明显低于野生型对照组小鼠,并且创面炎性细胞浸润也明显减少,尤其在伤后1-5天,创面IL-6、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-2)的表达都较野生型小鼠明显低[33]。由此可见,创面愈合过程中GM-CSF不仅促进愈合相关细胞因子分泌,还能促进炎症趋化蛋白分泌,促进炎症发生,发挥着促炎细胞因子的效应,在愈合的炎症期发挥重要作用。相反,Amrit Mann等[34]在过表达GM-CSF拮抗剂的转基因小鼠真皮损伤愈合过程中发现,实验组单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞浸润明显高于野生型小鼠,GMCSF对炎症细胞浸润具有拮抗作用,并认为GMCSF是作为一个抗炎因子在创面中发挥作用。不同研究结果可能是由于研究者实验因素的不同或其它尚未为被发现的机理造成。但就目前大多数实验的证据表明GM-CSF具有促炎效应。为此,我们可以肯定是GM-CSF参与了创面愈合的促炎症反应,并对炎症反应具有调控作用,创面GM-CSF表达异常可能导致创面炎症反应的异常,影响修复结局。

3.3 GM-CSF与增生期

巨噬细胞不仅在促进创伤愈合由炎症期向增生期转化起着重要作用,而且也是创伤愈合由炎症期向增生期转化的重要标志[35]。组织缺损后,创面基底部及边缘长出肉芽组织,逐渐填充缺损,肉芽组织主要由成纤维细胞、新生血管、巨噬细胞以及胶原等组成[36]。

增生期肉芽组织包括修复细胞的聚集,即成纤维细胞和血管内皮细胞的增殖和迁移、基质的沉积和新生血管的形成,主要通过成纤维细胞、血管内皮细胞的增殖和合成功能活动完成。新生的血管为创面愈合提供养料和氧分,贯穿于创面愈合反应的全过程[36]。而研究表明,GM-CSF是一种有效的促有丝分裂剂,体外可以直接刺激人成纤维细胞、内皮细胞的迁移和增殖以及人角质化细胞的生长,诱导新生血管的形成,加速再上皮化进程[29],所有这些均有助于促进创面肉芽组织形成增加和加速创面愈合。

3.3.1 GM-CSF对成纤维细胞的作用 成纤维细胞是创面愈合过程中最重要的效应细胞,也是创面肉芽组织的主要成份细胞,以合成细胞外基质和胶原为其功能特征,它在肉芽组织形成、伤口收缩、基质及胶原合成、伤口修复、瘢痕形成及无瘢痕愈合方面均起重要作用,多种细胞因子(IGF-1,PDGF,bFGF,KGF,TGF-β)可调控成纤维细胞生长及其活性[41]。GM-CSF能通过自分泌和旁分泌途径直接或间接作用于成纤维细胞。作为肉芽组织中的主要细胞成份之一的巨噬细胞,在GM-CSF的刺激作用下,能够大量合成有利于创面愈合的细胞因子,如PDGF、FGF和TGF等生长因子,促进成纤维细胞增殖及活性增强[29];研究发现正常人皮肤成纤维细胞表面表达GM-CSF受体(GM-CSFR)[37,38],通过受体介导,GM-CSF能直接作用于成纤维细胞。采用不同浓度的GM-CSF刺激体外培养人成纤维细胞,不但能刺激细胞GM-CSFR表达增加和细胞增殖,同时还能促进细胞肌动蛋白张力丝和纤连蛋白的表达,增加细胞外基质蛋白合成,而其对I型胶原基因表达呈抑制效应[42];因此,对于成纤维细胞,GM-CSF不仅有趋化、促进其增殖活性以及细胞合成功能的增强作用,利于肉芽组织的形成[38-40],而且还可间接促进其表达a-平滑肌肌动蛋白,转变为肌成纤维细胞[29],促进创面收缩,加速愈合。

3.3.2 GM-CSF对内皮细胞及新生血管形成的作用 通常在创面新生的肉芽组织中可见大量增生的血管内皮细胞索和增生的毛细血管,这些血管呈螺旋状、向表面呈垂直生长。这些新生血管为清创和组织修复提供重要的细胞成分。研究表明,GMCSF能够促进内皮细胞的趋化、增殖、分化及创面VEGF的表达,从而加速新生血管化,促进肉芽组织的形成[4,28,27]。

新生血管为肉芽组织提供营养,是肉芽组织生长过程中营养物质输入管道,足量的新生血管是肉芽组织生长的基础。Wang等[43]在鼠骨髓单核细胞来源的内皮祖细胞中,加入含有GM-CSF的培养基发现其能诱导内皮细胞形成集落,免疫组化显示集落细胞抗vWF,CD31和flk-1阳性。MT T实验还表明GM-CSF可以显著促进内皮祖细胞增殖,使多数细胞状态处于DNA合成期(S期),并且细胞表现出典型的内皮细胞样形态,其增殖曲线也与内皮细胞条件培养基增殖曲线形态类似;另外,在体外诱导Matrigel细胞形成的人脐带静脉内皮细胞(H UVECs)中,加入GM-CSF后发现有血管管腔样结构形成,而且CD34阳性表达率在一定范围内与GMCSF呈剂量及时间依赖效应[44];方勇等[45]在GMCSF基因缺失小鼠(GM-CSF-KO)创面发现其愈合率从伤后3天起就明显低于野生型小鼠,伤后7天GM-CSF-KO小鼠CD31的阳性表达率低下,认为GM-CSF基因缺失直接导致创面血管内皮细胞的增殖和迁移能力下降,影响了创面炎症细胞(如PMN和MФ)的趋化及活化能力,相应的细胞因子如 PDGF、FGF 、VEGF 、TGF-β 和血管生成素表达及其活性也可能被抑制;Cianfarani等[4]用GMCSF皮内注射治疗8例小腿慢性静脉性溃疡后,溃疡面积减少了30%～100%,治疗后创面活检发现CD31密度增加,增殖细胞核蛋白(PCNA)阳性细胞显著增加,溃疡基底部VEGF表达增加,伴巨噬细胞大量浸润,推测其机制为:GM-CSF通过募集巨噬细胞并增强其功能,清除局部有害物质,增加VEGF的分泌[4],促进新生血管的生成,加速创面的愈合。可见GM-CSF不仅可以直接活化增殖内皮细胞,诱导内皮细胞形成管腔,还能够通过趋化炎性细胞间接发挥其血管生成效应。

3.3.3 GM-CSF对再上皮化的作用 健康的表皮角化细胞增殖缓慢,当皮肤受损炎症反应刚刚启动时,角化细胞就被激活转变为高度增殖的、迁移的细胞,他们产生特异角蛋白使他们的细胞骨架发生改变,同时产生并分泌多种细胞外基质成分和信号多肽,参与损伤愈合过程[46]。研究证实,愈合增殖期GM-CSF能加强趋化角质细胞,通过刺激新生角化上皮增殖、迁移、分化和存活参与并加速创面的再上皮化[19,20,27,28,48]。GM-CSF注射部位的组织学观察显示表皮的厚度因为角质化上皮细胞数目的增加和体积的增大及层数的增加而增厚,且GM-CSF注射部位的表皮蛋白、角蛋白等物质表达增加,而这些蛋白的表达增加正好是角质化上皮细胞迅速分化的结果[47,29]。

用GM-CSF刺激体外培养的新生儿包皮角化细胞,发现细胞增殖明显,加入GM-CSF拮抗剂后,增殖效应消失[49]。程瑞杰,方勇等将GM-CSF凝胶用于治疗糖尿病小鼠创面时,观察到创面再上皮化速率增加,胶原蛋白合成加速,GM-CSF有促进创面闭合作用[50]。Amrit Mann等[34]观察切除过表达角化细胞衍生的GM-CSF的转基因小鼠皮肤时,发现创面除了新生肉芽组织含量,成纤维细胞数量,血管生成速率都快于野生型小鼠外,其再上皮化速度,痂壳排斥时间明显领先对照组小鼠,并且创面IL-6,INF-γ,TNF-β1 含量也显著升高 ;Simka[51]认为GM-CSF作为一种促炎症因子,通过趋化作用募集骨髓衍生细胞(BMDC)到达受损部位,BMDC随即分化为一种特殊的基底角化细胞-过渡性增殖细胞(TA),TA能快速增殖,能在较短时间内覆盖皮肤的缺损。可见,GM-CSF对于角化细胞有明显的促增殖作用,能使创面快速上皮化以覆盖创面。同时,Breuhahn等[52]报道称GM-CSF除了诱导角化细胞增殖外,同时也可以活化角化细胞凋亡程序。虽然在过表达GM-CSF小鼠创面有丝分裂活性升高,但最终其增生的表皮厚度及分化程度都与正常皮肤接近,表明GM-CSF参与调节角化上皮细胞增殖与凋亡的平衡和表皮内环境的稳定,使得创面上皮再生向着正常形态发展[51]。

3.4 GM-CSF在组织塑形期的作用

塑形期主要是成纤维细胞合成大量胶原及细胞外基质成分,并释放胶原酶对细胞外基质进行改建的过程。主要变现为肉芽组织逐渐成熟,即肉芽组织向瘢痕纤维化组织转变。研究证实通过调节创面TGF-β的表达,促进缺损处修复胶原纤维的正常沉积[53]、增强愈合处的抗撕裂力[39]及使修复上皮正常化[30,46],从而提示GM-CSF参与组织重塑。GMCSF既可增加伤口的收缩、也可增强创口周围组织的抗张力强度。

在此阶段,成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,表达α-平滑肌肌动蛋白,肌成纤维细胞在创伤愈合中作用一是促进伤口收缩,二是促进肉芽组织纤维化。Vyalov S等[62]在大鼠肉芽组织周围安装一个渗透性微泵,给予GM-CSF,微泵植入后三天,GM-CSF就诱导了炎症反应的发生,以水肿和单核巨噬细胞聚集为主,而后单核细胞减少,巨噬细胞形成细胞团。微泵植入后四天,α-SMA开始出现并持续升高,七天到达峰值。最开始的α-SMA阳性细胞发现在紧挨着巨噬细胞周围,实验表明GM-CSF比PDGF更有效地聚集巨噬细胞,能更好诱导α-SMA阳性细胞的形成。但是Shephard等[63]研究表明,GM-CSF和TGF-β,ET-1连用时候发现,GM-CSF阻止了成纤维细胞表达α-SMA,GM-CSF通过激活NfkappaB通络,阻碍了 TGF-β信号通络,阻碍了α-SMA的形成。所以GM-CSF对于肌成纤维细胞的诱导到底发挥着怎样的作用,还需要进一步的探讨。

4 GM-CSF在不同创面治疗的临床应用

慢性难愈性创面一直是困扰临床医生的难题[22]。主要分四类:静脉性溃疡、糖尿病性溃疡、压力性溃疡和缺血性溃疡等[54]。GM-CSF已被试用于此类疾病的治疗,效果令人满意。

糖尿病创面及溃疡是极具代表意义的难愈创面,也是目前医学界面临的重大难题。糖尿病主要因血管病变致局部缺血、中性粒细胞和巨噬细胞的功能受损、血管病变及内皮细胞异常、成纤维细胞增殖能力降低、易感染等,导致创面难以愈合[3,55]。局部注射GM-CSF可促进糖尿病者足部慢性神经性溃疡的愈合[56];创面均匀滴用GM-CSF亦能使糖尿病脂性渐进性坏死患者的小腿慢性溃疡愈合,而且持续3年以上无复发[57]。从而推论局部应用GM-CSF可能是治疗糖尿病患者伴发慢性迁延不愈创面的一种有效方法。

长期存在的下肢肢端静脉性溃疡是最常见的慢性溃疡,严重影响患者的生活,加重社会负担,目前尚无理想疗法。国外已有一系列应用rhGM-CSF促进静脉性溃疡愈合的报道。1994年,DaCosta等[21]首次将rhGM-CSF用于慢性下肢溃疡的老年人,溃疡周围皮下注射 rhGM-CSF使其痊愈;El Saghir等[58]在1997年首次报道在溃疡周围及底部注射rhGM-CSF成功使压力性溃疡愈合,并发现溃疡是从注射部位开始愈合,随诊9个月无复发。另一项临床研究表明对压力性溃疡局部连续喷洒rh-GM-CSF,可使溃疡体积明显减小,利于愈合[59];Daniel A等人局部皮下注射GM-CSF治疗由于不同病因导致的中性粒细胞功能障碍而引起的难愈性创面时,发现创面在4周内全部愈合且局部应用副作用小,还能最大限度地缩短住院时间和治疗费用[60];Raderer等局部应用的GM-CSF治疗10例癌症病人由于手术和褥疮而产生的慢性创面,治疗五天后创面好转,治疗后所有病人创面都愈合,除了一例病人由于浓度过高(200ug/ml)局部有灼烧感外,其余病人(4ug/ml)无副反应,且局部应用GMCSF不影响外周血细胞数量[61]。

5 展望

目前创面愈合是许多学科面临的一大难题,GM-CSF随着越来越多地临床中的应用,肯定了GM-CSF对于慢性不愈创面的促愈作用,但其主导作用机制尚不清楚。Simka[51]认为慢性创面的难愈合主要原因是由于骨髓衍生角化细胞前体(BMDC)向创面聚集受限,机制可能是由于BMDC的趋化因子-皮肤T细胞黏附因子(CTACK/CCL27)功能受限所致,主要原因为创面存在大量CTACK/CCL27抑制因子PSGL-1从活化的中性粒细胞表面脱落所产生的抑制效应所致。怎样使GM-CSF促炎症发挥到最大的抗异物、抗菌效应,又不影响后续皮肤组织再生?GM-CSF的应用会不会带来由于成纤维细胞过分增殖而分泌大量细胞外基质,导致胶原的过量合成和沉积?局部用药会不会增加外周血GM-CSF浓度和血细胞数量而产生副作用?以及创面用药最佳时机,用药时间及剂量、剂型等,还需进一步研究。

[1]陈炯,韩春茂,陈国贤,等.重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子凝胶剂促进深Ⅱ度烧伤的愈合[J].中华创伤杂志,2008,24(3):224-227.

[2]Sieff CA,Emerson SG,Donahue RE,et al.Human recombinant granulocy te macrophage colony stimulating factor:A multilineage hematopoietin[J].Science,1985,230(4730):1171-1177.

[3]程瑞杰,方勇.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子与创面愈合[J].中华医学杂志,2006,86(24):1726-1728.

[4]Cianfarani F,T ommasi R,Failla CM,et al.Granulocy te/macrophage colony-stimulating factor treatment of human chronic ulcers promotes angiogenesis associated with de novo vascular endothelial growth factor transcription in the ulcer bed[J].Br J Dermatol,2006,154(1):34-41.

[5]Masucci G,Wersill P,Ragnhammar P.Granulocyte-monocyte colony-stimulat-ing factor augments the cytotoxic capacity of lymphocytes and monocytes in antibody-dependent cellular cytotoxicity[J].Cancer Immunol Immunother,1989,29:288-292.

[6]杨永华,陈炯.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在创面愈合中的应用进展[J].实用医学杂志,2008,24(19):3435-3438.

[7]Hubel K,Dale DC,Liles WC.Therapeutic use of cytokines to modulate phago-cyte function for the treatment of infectious diseases:current status of granulo-cyte colony-stimulating factor,granulocy te-macrophage colony-stimulating factor,macrophage colony-stimulating factor,and interferon-gamma[J].J Infect Dis,2002,185:1490-1501.

[8]Hamilton JA,Anderson GP.GM-CSF biology[J].Growth Factors,2004,22:225-231.

[9]Breuhahn K,Mann A,Muller G,et al.Epidermal overex pression of g ranulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces both keratinocyte proliferation and apoptosis[J].Cell Growth Differ,2000,11:111-121.

[10]陈文超,艾晓杰,乔中东.人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子研究进展[J].上海交通大学学报,2004,22(2):204-207.

[11]T arr PE.G ranulocyte-macrophage colony-stimulating factor and the immune system[J].Med Oncol,1996,13(3):133-140.

[12]T anaka M,Dykes PJ,Marks R.Keratinocy te g rowth stimulation by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GMCSF)[J].Keio J Med,1997,46(4):184-187.

[13]Prevost JM,Farrell PJ,IatrouK,et al.Determinants of the functional interaction between the soluble GM-CSF receptor and the GMCSF receptor beta-subunit[J].Cytokine,2000,12(3):187-197.

[14]Montagnani S,Postiglione L,Giordano-Lanza G,et al.Granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF)biological actions on human dermal fibroblasts[J].Eur J Histochem,2001,45(3):219-228.

[15]Warren TL,Weiner GJ.Uses of g ranulocyte-macrophage colony-stimulating factor in vaccine development[J].Curr Op in Hematol,2000,7:168-173.

[16]Stagno F,Guglielmo P,Consoli U,et al.Successful healing of hydroxyurea-related leg ulcers with topical granulocy te-macrophage colony-stimulating factor[J].Blood,1999,94:1479-1480.

[17]Bussolino F,Ziche M,Wang JM,et al.In vitro and in vivo activation of endoth-elial cells by colony stimulating factors[J].J Clin Invest,1991,87:986-995.

[18]Mann A,Breuhahn K,Schirmacher P,et al.Keratinocyte derived granulocy te-macrophage colony stimulating factor accelerates wound healing:stimulation of keratinocyte proliferation,g ranulation tissue formation,and vascularization[J].J Invest Dermatol,2001,117:1382-1390.

[19]Breuhahn K,Mann A,Muller G,et al.Epidermal overexpression of granulocyte-macrophage colony stimulating factor induces both keratinocyte proliferation and apoptosis[J].Cell Growth Differ,2000,11:111-121.

[20]Kaplan G,Walsh G,Guido LS,et al.Novel responses of human skin to intradermal recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor:Langerhans cell recruitment,keratinocy te g rowth,and enhanced wound healing[J].J Exp M ed,1992,175:1717-1728.

[21]Da Costa RM,Ribeiro Jesus FM,Aniceto C,et al.Randomized,double-blind,placebo-controlled,dose-ranging study of g ranulocyte-macrophage colony stimulating factor in patients with chronic venous leg ulcers[J].Wound Repair Regen,1999,7(1):17-25.

[22]Groves RW,Schmidt-Lucke JA.Recombinant human GMCSF in the treatment of poorly healing wounds[J].Adv Skin Wound Care,2000,13(3):107-112.

[23]M oosbauer C,M orgenstern E,Cuvelier SL,et al.Eosinophils are a major intrav-ascular location for tissue factor storage and exposure[J].Blood,2007,109(3):995-1002.

[24]M alik IA,ZahidM,Haq S,et al.Effect of subcutaneous injection of Granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF)on healing of chronic refractory wounds[J].Eur J Surg,1998,164:737-744.

[25]Falanga V.Wound healing and its impairment in the diabetic foot[J].Lancet,2005,366:1736-1743.

[26]Jones T C.The effects of rhGM-CSF on macrophage function[J].Eur J Cancer,1993,29A(S3):10-13.

[27]M ann A,Niekisch K,Schirmacher P,et al.Granulocyte-macrophage colony-stimulating facto r is essential fo r normal wound healing[J].J Investig Dermatol Symp Proc,2006,11(1):87-92.

[28]Mann A,Breuhahn K,Schirmacher P,et al.Keratinocy te-derived Granulocy te-macrophage colony stimulating factor accelerates wound healing:Stimulation of keratinocyte proliferation,granulation tissue formation,and vascularization[J].J Invest Dermatol,2001,117(6):1382-1390.

[29]M alik IA,Zahid M,Haq S,et al.Effect of subcutaneous injection ofgranulocyte-macrophage colony stimulating factor(GM-CSF)on healing of chronic refractory wounds[J].Eur J Surg,1998,164(10):737-744.

[30]Fang Y,Gong SJ,Xu YH,et al.Impaired cutaneous wound healing in granulocy te/macrophage colony-stimulating factor knockout mice[J].Br J Dermatol,2007,157(3):458-465.

[31]Paul D,Smith MD,M Ann Kuhn M D,et al.Initiating the Infammatory Phase of Incisional Healing prio r to Tissue Injury[J].Journal of Surgical Research,2000,92(1):11-17.

[32]Robson M,Kucukcelebi A,Carp SS,et al.Effects of Granulocy te-M acrophage Colony-Stimulating Factor on Wound Contraction[J].Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis,1994,13:41-46.

[33]Y.Fang,S-J Gong,Y-H Xu,et al.Impaired wound healing in granulocyte macrophage colony-stimulating factor knockout mice[J].Cutaneous Biology,2007,10:1-8.

[34]Amrit Mann,Kerstin Niekisch,Peter Schirmacher.G ranulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Is Essential for Normal Wound Healing[J].Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings,2006,11:87-92.

[35]Atif D,Agaiby,Dyson M.Immuno-inflammatory cell dy namics during cutane-ous wound healing[J].J Anat,1999,195:531-542.

[36]李春昌,李景华,张丽华.创面的分期及影响创面愈合的因素[J].中国社区医师,2007,24:3.

[37]Postiglione L,M ontagnani S,Riccio A,et al.Expression of GM-CSF receptor and “in vitro” effects of GM-CSF on human fibroblasts[J].Life Sci,1998,63(5):327-336.

[38]Montagnani S,Postiglione L,Giordano-Lanza G,et al.Granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF)biological actions on human dermal fibr-oblasts[J].Eur J Histochem,2001,45(3):219-228.

[39]Jyung RW,Wu L.Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and g ranulocyte colony-stimulating factor:differential action on incisional wound healing[J].Surgery,1994,115(3):325-334.

[40]Jaschke E,Zabernigg A,Gattringer C.Recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor applied locally in low doses enhances healing and prevents recurrence of chronic venous ulcers[J].Int J Dermatol,1999,38(5):380-386.

[41]王益民,韦福康,刘明.成纤维细胞与创伤修复的研究进展[J].中国修复重建外科杂志,2000,14(2):126-128.

[42]Postiglione L,Ladogana P,Montagnani S,di Spigna G,Castaldo C,Turano M,Bruno EM,Di Meglio F,Riccio A,Rossi G.Effect of granulocy te macrophage-colony stimulating facto r on ex tracellular matrix deposition by dermal fibroblasts from patients with scleroderma[J].J Rheumatol,2005,32(4):656-664.

[43]Q i Ru Wang,Feng Wang,Wen Biao Zhu.GM-CSF accelerates proliferation of endothelial progenitor cells from murine bone marrow mononuclear cells in vitro[J].Cy tokine,2009,45:174-178.

[44]赵薇,杨向红,王延琳.GM-CSF对诱导人血管内皮细胞血管形成的影响及VEGF的作用[J].中国病理生理杂志,2007,23(4):682-685.

[45]方勇,龚圣济,王莹,等.单核细胞集落刺激因子缺失对小鼠创面愈合与新生血管化的影响[J].中华整形外科杂志,2007,23(3):233-235.

[46]Amrit Mann,Kerstin Niekisch,Peter Schirmacher.G ranulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Is Essential for Normal Wound Healing[J].Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings,2006,11:87-92.

[47]Braunstein S,Kaplan G,Gottlieb AB,et al.GM-CSF activates regenerative epidermal growth and stimulates keratinocyte proliferation in human skin in vivo[J].J Invest Dermatol,1994,103:601-604.

[48]Hancock WW,Pleau ME,K obzik L.Recombinant granulocy te-macrophage colony-stimulating factor down-regulates expression of IL-2 receptor on human mononuclear phagocy tes by induction of prostaglandin[J].E.J Immunol,1988,140:3021-3025.

[49]Akira Kawada,Masataro Hiruma,Hiromitsu Noguchi.Granulocy te and macrophage colony-stimulating factors stimulate proliferation of human keratinocytes[J].Arch Dermatol Res,1997,289:600-602.

[50]程瑞杰,方勇,俞为荣.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对糖尿病小鼠创面愈合的作用[J].上海交通大学学报,2007,27(4):415-418.

[51]M Simka.Delayed healing of chronic leg ulcers can result from impaired traf?cking of bone marrow-derived precursors of keratinocytes to the skin[J].M edical Hypotheses,2007,69:637-641.

[52]Kai Breuhahn,Amrit Mann,Gabriele Mu¨ller.Epidermal Overexpression of Granulocy te-M acrophage Colony-Stimulating Factor Induces Both Kerati-nocy te Proliferation and Apoptosis[J].Cell G rowth &Differentiation,2000,11:111-121.

[53]Masucci G.New clinical applications of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor[J].Med Oncol,1996,13(3):149-154.

[54]M eier K,Nanney L B.Emerging new drugs for wound repair[J].Expert Opin Emerg Drugs,2006,11(1):23-37.

[55]王正国,付小兵,周元国.分子创伤学[M].福州:福建出版社,2004,526-529.

[56]Wheeler G,Brodie G N.GM-CSF and wound healing[J].Med J Aust,1998,168(11):580.

[57]Kari Remes,T apani Ro¨nnemaa.Healing of Chronic Leg Ulcers in Diabetic Necrobiosis Lipoidica with Local Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor T reatment[J].Journal of Diabetes and Its Complications,1999,13:115-118.

[58]Saghir N S,Bizri A R,Shabb N S,et al.Pressure ulcer accelerated healing with local injections of granulocyte macrophagecolony stimulating factor[J].J Infe-ct,1997,35(2):179-182.

[59]Robson M C,Hill D P,Smith P D,et al.Sequential cytokine therapy for pressure ulcers:clinical and mechanistic response[J].Ann Surg,2000,231(4):600-611.

[60]Daniel A.De Ugarte?Robert L.Roberts Paisal Lerdluedeeporn Treatment of chronic wounds by local delivery of g ranulocyte-macrophage colony-stimulating factor in patients with neutrophil dysfunction[J].PediatrSurg Int,2002,18:517-520.

[61]Raderer M,Hejna G KM.Topical Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor in Patients With Cancer and Impaired Wound Healing[J].Journal of the National Cancer Institute,1997,89(3):263.

[62]Vyalov S,Desmouliè re A,Gabbiani G.GM-CSF-induced granulation tissue formation:relationships between macrophage and myofibroblast accumulation[J].Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol,1993,63(4):231-239.

[63]Shephard P,Hinz B,Smola-Hess S.Dissecting the roles of endothelin,TGF-beta and GM-CSF on myofibroblast differentiation by keratinocytes[J].T hromb Haemost,2004,92(2):262-274.