猪瘟病毒分子生物学诊断的研究进展

季慕寅

(芜湖职业技术学院,安徽芜湖 241000)

猪瘟病毒分子生物学诊断的研究进展

季慕寅

(芜湖职业技术学院,安徽芜湖 241000)

猪瘟是由猪瘟病毒引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病,严重危害我国养猪业。尽管中国很早就研制成功了猪瘟兔化弱毒疫苗,但近年来猪瘟的流行和发病特点发生了很大的变化,很多地区和猪场不断出现非典型猪瘟、温和型猪瘟,给该病的诊断带来了困难。近年来,猪瘟病毒分子生物学诊断方法的研究进展迅速,为猪瘟的快速、准确诊断起到了重要的作用。从聚合酶链式反应技术、核酸探针技术、DNA芯片技术等方面对猪瘟病毒的分子生物学诊断方法进行了综述。

猪瘟病毒;分子生物学诊断;聚合酶链式反应技术;核酸探针技术;DNA芯片

猪瘟(classical swine fever)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的猪的一种急性、热性和高度接触性传染病。它分布范围广,危害程度高,给养猪业造成了巨大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病,我国农业部动物疫病分类方法中被列为一类动物疫病。猪瘟兔化弱毒疫苗是我国上世纪五十年代研制的世界公认的最优秀的猪瘟疫苗。利用该疫苗,我国成功控制了猪瘟的爆发。近几年来,原已消灭猪瘟的欧洲一些国家又陆续爆发猪瘟[1],我国猪瘟发病率也不断上升,并且呈现新的发病特点,主要表现在:从频发的大流行转变为无规律的散发性流行;自然病例中常见病理变化不典型、临床症状轻微的非典型或温和型猪瘟;出现持续性感染、胎盘感染、母猪繁殖障碍以及新生仔猪先天性感染。一直以来,对猪瘟病毒的快速准确的检测和诊断都是猪瘟综合防治过程中的难点和重要环节,而猪瘟发病特点的改变给猪瘟病毒的诊断又提出了新的挑战。由于现在多为温和型猪瘟,临床症状不明显,因此现在猪瘟的诊断更多依赖于实验室诊断。其中,分子生物学诊断技术就是一种快速、有效的诊断方法。它主要针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和结构进行测定,从而检测和鉴别病原微生物。近几年以来,CSFV分子生物学诊断方法发展迅速。本文就CSFV分子生物学诊断方法进行综述,以期对猪瘟的快速、准确的诊断提供帮助。

1 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术

1.1 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)

RT-PCR诊断技术是从患病动物感染组织中提取总RNA作为模板,应用特异性引物进行反转录,产生的cDNA再用聚合酶进行扩增,扩增产物用琼脂凝糖胶电泳检测的一种技术。该方法特异性强、敏感度高、重复性好,并且操作简单、快速,已经广泛应用于 CSFV的检测。汤波[2]等建立了针对 CSFVE2基因的PT-PCR检测方法,对30个样品进行敏感性、特异性、灵敏度和重复性检测后证明该检测方法可以检测出21株CSFV中的20株,敏感性达95.24%,灵敏度可以达到 8.9pg/μL,重复率在91.1%-100%。此外,该方法不能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV),猪细小病毒(PPV),猪呼吸与繁殖综合症病毒(PRRSV)等常见猪病病原,说明其具有良好的特异性。Shiu[3]等利用RT-PCR对CSFV台湾分离株的E1、E2和 E3基因进行了扩增,并将其分别克隆至 PUC19中进行测序,鉴定了该菌株的同源性。胡仁莉[4]等将RTPCR与限制性内切酶图谱分析方法相结合,快速区别了猪瘟强毒株和流行株。虽然RT-PCR有着不可比拟的优点,但是由于在自然环境中RNA容易降解,RT-PCR结果往往会受到样品中RNA稳定性的影响,当样品中病毒含量极微量时,RT-RCR不能达到检测的目的。

1.2 套式RT-PCR(RT-nPCR)

RT-nPCR是利用两对PCR引物扩增目的片段的方法,它可以弥补RT-PCR的不足,克服检测过程中病毒含量低的问题。罗勇[5]等建立了 CSFVRT-nPCR的方法,结果表明其敏感性比普通的RT-PCR提高了100倍。朱小甫[6]等优化了CSFV RT-nPCR,检测CSFV cDNA的含量可以达到1× 10-7ng/mL。此外,RT-nPCR还提高了PCR的特异性。因为第二对引物是在第一次扩增产物的内部,以第一次扩增产物为模板进行反应。如果第一次扩增产生了错误片断,则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此,RT-nPCR的扩增非常特异。

1.3 荧光定量PCR

荧光定量PCR技术以其高灵敏度、高特异性、便捷快速等优点在病原体的定性和定量方面得到了广泛应用。温国元[7]等利用荧光定量PCR法快速检测样品中的CSFV,同时将该方法与RT-PCR和RT -nPCR相比较,发现荧光定量PCR具有更高的敏感度,是RT-PCR的100倍。G.T.Fosgate等建立了快速区别CSFV与口蹄疫病毒和瘟病毒属内其它病毒的荧光定量PCR方法。通过荧光定量PCR对人工感染猪体内CSFV含量进行了动态的监测。荧光定量PCR不仅运用于CSFV的检测,陈玉栋[8]等还将其与Lightcycler荧光检测系统相结合,建立了快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的方法。

荧光定量PCR检测模式有很多种,在CSFV检测中主要运用SYBR Green I检测模式和水解探针模式(Taqman)。Jamnikar[9]等对这两种模式进行了比较,发现在荧光定量PCR检测CSFV的过程中,二者表现出一致的特异性,但是由于SYBR Green I检测模式采用的是通用引物,对非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,因此其敏感性低于水解探针模式。最近,研究者采用一种新颖的荧光定量PCR检测模式来检测猪瘟,即引物探针能量转移荧光定量PCR(PriProET real-time PCR)。此方法与SYBR法和Taqman法都不同,它是依靠能量转移产生荧光信号,探针的3′端标记一个受体荧光基团,然后在下游引物的5′端标记供体荧光基团。PCR扩增之后,随着解链温度的增加,探针和标记有供体荧光基团的扩增子逐渐分离。分析熔解曲线可以证实特异性扩增子的存在。由于探针和扩增子之间的不匹配,可以导致其解链温度低于匹配的解链温度,因此该方法可以用来鉴定CSFV,包括疫苗株。BVDV-1、BVDV -2、BVDV-3和BDV等57个相关病毒进行检测,结果表明,只能检测出CSFV,并且试验的敏感性最小达到20拷贝,此方法为诊断猪瘟提供了一种新的方法。

1.4 多重PCR

多重PCR又称复合PCR,其反应原理、方法等均与普通PCR相一致,不同之处在于其运用两对或两对以上的引物,扩增出多个核苷酸片段,因此适用于临床大量样品中病原微生物的检测。Heidy[10]等针对瘟病毒属5’端非编码区域基因和CSFVNS5B基因分别设计了瘟病毒属特异性引物和CSFV种特异性引物,利用多重PCR,将CSFV与属内其它病毒相区分,其敏感性可达到0.89TCID50。Yu-Liang Huang等结合实时 PCR,建立了高特异性、快速的CSFV基因分型的多重PCR方法。

2 核酸探针技术

核酸探针技术是在分子标记的基础上,对已知序列的核酸标记上同位素、地高辛、生物素等,制成探针。根据碱基配对原则,使模板核酸与探针反应。利用酶-底物反应或放射自显影法,观察是否出现预期的条带或斑点,从而做出准确诊断的方法。该方法敏感性高,特异性强,方便快捷,可以从混合标本中正确鉴定出目的病原微生物。利用CSFV基因组RNA构建的cDNA,与BVDV进行了序列分析和比较,合成6个探针,按照它们在病毒基因组的位置,根据特异的杂交条带可以区别CSFV、BVDV和BDV。

3 DNA芯片技术

DNA芯片又称为基因芯片、微阵列,属于生物芯片的一种,是在核酸杂交、测序的基础上发展起来的。它的出现使快速鉴别大量基因序列成为了可能。随着技术和设备的日趋成熟,成熟的商品化芯片日益增多,国外已有用于动物传染病诊断的报道。运用多样DNA悬液芯片同时鉴别出CSFV和瘟病毒属的其他病原微生物,敏感性可以达到0.2-10 TCID50/ ml。Douglas[11]等从244000条可以与感染和未感染的巨噬细胞RNA相杂交的探针中筛选出44000条,做成DNA芯片,用来检测感染CSFV的猪体内巨噬细胞基因表达的变化。

4 环介导的反转录—等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)

RT-LAMP是由日本学者于2000年建立。它利用6条引物(包括一对外部引物、一对内部引物和一对环引物)利用链置换DNA聚合酶在等温条件下,几十分钟就可扩增出靶序列。该方法用时短,对设备要求低,且比普通PCR的敏感性高,非常适合于基层和现场使用。Chen等分别用 RT-LAMP和RT-PCR的方法对157份临床疑似CSFV感染的样品进行了检测,结果表明,所有病样CSFV RTLAMP的阳性检出率为26.11%,而 CSFV RT-nPCR的阳性率为14.65%,两种方法之间的符合率为85.35%。此外,RT-LAMP敏感度是RT-PCR的100倍。

5 分子生物学诊断与免疫学诊断方法相结合

随着现代科学技术的发展,诊断方法的改进正发生着日新月异的变化,越来越多的分子生物学诊断技术与免疫学诊断技术相结合,并被广泛应用于病原微生物的诊断过程中。为了建立一种敏感、特异、快速的CSFV诊断方法,将RT-PCR与ELISA相结合,使PCR产物在杂交有特异性探针的微孔板上进行ELISA反应,从而鉴别出CSFV。该ELISA-RTPCR方法不仅具有更高的特异性,而且克服了假阳性的可能。

[1]A.J.Peredaa,I.Greiser-Wilkeb,B.Schmitt,et al.Phylogenetic Analysis of Classical Swine Fever Virus(CSFV) Field Isolates From Outbreaks in South and Central America[J].Virus Reseach,2005,110(1-2):111-118.

[2]汤波.猪瘟病毒 E2基因RT-PCR检测方法的建立及病毒分子流行病学研究[D].重庆:西南大学(硕士学位论文),2009.

[3]Jiun-shan Shiu,Mong-hsiung Chang,Shih-tung Liu,et al.Molecular Cloning and Nucleotide Sequence Determination of Three Envelop Genes of Classic Swine Fever Virus Taiwan Isolate p97[J].Virus Research,1996,41(2):173-178.

[4]胡仁莉.猪瘟分离毒 E2基因序列分析和强弱毒检测方法的探讨[D].扬州:扬州大学(硕士学位论文),2006.

[5]罗勇.猪瘟病毒套式RT-PCR检测方法的建立和种猪场猪瘟免疫与净化研究[D].武汉:华中农业大学(硕士学位论文),2009.

[6]朱小甫,张志,李小成,等.猪瘟病毒RT-nested PCR检测方法的优化和应用[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2007,35(6):11-14.

[7]温国元,万超,潘兹书,等.应用荧光定量PCR技术快速定量检测猪瘟病毒[J].武汉大学学报(理学版),2004,50 (6):746-750.

[8]陈玉栋,张楚瑜,邹俊煊,等.建立快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量 PCR技术[J].中国病毒学,2003,18 (2):124-128.

[9]Urska Jamnikar Cigleneckia,Joze Groma,IvanToplak,et al.Real-time RT-PCR Assay for Rapid and Specific Detection of Classical Swine Fever Virus:Comparison of SYBR Green and TaqMan MGB Detection Methods Using Novel MGB Probes[J].Journal of Virological Methods, 2008,147(2):257-264.

[10]Heidy Diaz de Arce,Lester J.Perez,Maria T.Frias,et al. A multiplex RT-PCR Assay for the Rapid and Differential Diagnosis of Classical Swine Fever and Other Pestivirus infections[J].Veterinary Microbiology,2009,139(3-4): 245-252.

[11]Douglas P.Gladue,James Zhu,Lauren G.Holinka,et al. Patterns of Gene Expression in Swine Macrophages Infected with Classical Swine Fever Virus Detected by Microarray[J].Virus Research,2010,151(1):10-18.

Advance of Molecular Biology Diagnosis for Classical Swine Fever Virus

J I Mu-yin
(W uhu Vocational Technical College,W uhu241000,China)

Classical swine fever,caused by classical swine fever virus(CSFV),is an acute febricity contagious disease,which has an important effect on pig-breeding industry of our country.Recently,great changes in prevalence and pathogenesis characteristics of classical swine fever have emerged.The non-typical or mild classical swine fever prevailed in many areas and pig farms,which makes the CSFV diagnosis harder.With the rapid development,molecular biology diagnosis has been widely used in the diagnosis of CSFV.To diagnose CSFV efficiently in clinical,molecular biology diagnosis for CSFV was summed up from Polymerase chain reaction technology,nucleic acid probe technology and gene chip technology.

classical swine fever virus(CSFV);molecular biology diagnosis;polymerase chain reaction(PCR);nucleic acid probe; gene chip

S852.3

A

1009-9735(2010)05-0077-03

2010-09-03

季慕寅(1974-),男,安徽无为人,讲师,硕士,高级技师,研究方向:动物传染病。