BMP2活性多肽/鼠尾Ⅰ型胶原复合物植入异位成骨的实验研究

李景峰 郑启新 郭晓东 卢宏伟 林振宇 兰生辉

(华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，武汉 430022)

引言

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)是目前能够诱导骨组织形成的一类局部生长因子，其中以 BMP2的成骨能力最强[1]。本课题组自行设计并合成的 BMP2活性多肽是根据天然BMP2具有诱导成骨功能的核心功能区设计合成的含24个氨基酸的寡肽，在前期的体外细胞实验研究中，已证明其具有与BMP2类似的骨诱导活性[2-3]。

胶原支架材料被认为是骨形态发生蛋白载体的金标准[4]。鼠尾Ⅰ型胶原作为天然的生物材料，在结构和抗原性方面与人体组织的Ⅰ型胶原基本相同;同时胶原支架材料的三维空间结构具有一定的强度以及适宜的孔径，保持了天然的渗透性，对BMP2活性多肽可以起到锚定和支持作用，为细胞增殖和功能分化提供合适的微环境[5-6];而且它来源广泛，成分较为单一，制备比较方便[7]，是构建组织工程支架的良好原料。本实验利用鼠尾Ⅰ型胶原作为BMP2活性多肽的载体，植入大白鼠股四头肌肌袋，验证与评价BMP2活性多肽诱导成骨能力，为下一步临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 鼠尾Ⅰ型胶原

实验所用胶原为酸溶性鼠尾胶原，其主要成分为Ⅰ型胶原，参照文献的方法[7-8]进行提取，具体方法为：①从新鲜大鼠尾尾根部切断鼠尾，置于75%乙醇中浸泡30 min，抽出尾腱至于平皿中;②抽取的肌腱浸入70%酒精中浸泡20 min，剪碎，三蒸水清洗转移至0.5%乙酸中，每根鼠尾约250 mL，搅拌48 h，充分溶解;③冷冻离心，20000 r/min，20 min后取上清液;④1 mol/L NaOH滴定上清液，p H=7.0时，离心，20000 r/min，20 min取沉淀;⑤冷冻干燥(-60℃);⑥根据实验需要量将适量冻干后鼠尾Ⅰ型胶原溶解成胶冻状，保存于4℃冰箱中备用。

1.2 BMP2活性多肽

本课题组自行设计的BMP2活性多肽通过芴甲基羰基/叔丁氧基(FMOC/tBu)固相多肽合成法合成：采用对碱不稳定的9-芴甲基羰基保护氨基酸的α-氨基，采用对酸不稳定的叔丁基型或其它保护基团保护氨基酸的侧链官能团，用聚酰胺树脂作为多肽合成的固相载体。所得粗肽经过凝胶层析初步纯化，最后经过高效液相色谱法纯化，冷冻而得。经过高效液相色谱法纯化后纯度为96.8%，通过质谱仪对多肽进行序列鉴定。

1.3 材料复合与冻干

将胶冻状鼠尾胶原移至24孔板中的12孔，其中6孔为单纯胶冻状鼠尾胶原;另6孔首先在各孔底部覆盖一层鼠尾胶原，然后6孔各10mg BMP2活性多肽置于鼠尾胶原上，接着将剩余部分鼠尾胶原添加至BMP2活性多肽上面，使之形成一个“夹层”，最后用无菌针头将其混匀，整个过程在无菌超净台中进行，同时适当将温度降低，周围放置冰块。操作结束后将24孔板放入-20°冰箱中预冻存，最后放入冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)低温(-55℃)冷冻干燥24 h后消毒备用。

1.4 环境扫描电镜观察

将冻干后的鼠尾胶原支架材料从冻干机中取出，拍照，然后在环境扫描电镜(QUANTA200，FEI公司，荷兰)低真空模式下观察鼠尾胶原支架的孔隙结构。

1.5 动物实验

12只8周龄健康雄性 SD(Sprague-Dawley)大白鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，每只体重约230～250 g，将其随机分成 2组，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，约4 mL/kg。麻醉满意后，常规消毒铺巾，每只大白鼠右侧大腿作2 cm的切口，制备股四头肌肌袋模型，将上述材料适当压缩后分别植入股四头肌肌袋肌间隙中，逐层缝合伤口。观察指标：①肉眼观察：肉眼观察术后动物的一般情况和伤口的愈合情况;②放射学检查(X-ray，CT)：术后3周和6周观察成骨情况;③术后6周取出样本行组织学观察，分别作组织学切片，HE染色，在光镜下观察新骨形成情况。

2 结果

2.1 环境扫描电镜观察鼠尾胶原

鼠尾胶原支架材料冻干后在环境扫描电镜低真空模式下观察，可见冻干后的鼠尾胶原纤维相互链接成多孔网状结构，孔径大小在90～160 μm之间(如图1)，而复合BMP2活性多肽后胶原网状结构无明显改变。据国内外的研究表明，胶原支架的最适宜的孔径大小在50～150μm之间，此大小的孔径可以为细胞的浸入、增殖及血管化提供适宜的空间[9]。实验结果表明鼠尾胶原支架孔径大小与最适宜的孔径大小基本相吻合。胶原支架孔间相互连通成多孔网状结构，孔径大小基本一致，有利于养料的传输和血管化顺利的进行。

图1 鼠尾Ⅰ型胶原。(a)为单纯鼠尾胶原冻干后照片;(b)复合 BMP2活性多肽鼠尾胶原冻干后照片;(c)鼠尾胶原冻干后在环境扫描电镜低真空模式下观察所见(160×)Fig.1 Rat rail collagen.(a)pure rat rail collagen after freeze-dried;(b)the BMP2-derived peptide/rat rail collagen complex after freeze-dried;(c)the structure of rat rail collagen after freeze-dried under low-vacuum electron microscopy(magnification，160×)

2.2 动物一般情况

术后给予青霉素抗感染，所有大白鼠活动、进食正常，伤口I/甲愈合，无红肿、渗液等。3周时，实验组植入区周围组织质地稍硬，6周时，实验组植入区硬度明显增加;而对照组3周与6周时，植入区周围组织硬度无明显变化。所有大白鼠均健康生存直至取材。

2.3 放射学检查

2.3.1 X线片观察：3周时，对照组植入材料区域无明显的成骨现象，而实验组植入材料区域可见钙化影形成。6周时，实验组植入材料区域可见块状的明显钙化影形成，密度比正常骨形成应要低，而对照组仍无明显的成骨现象。(见图2)。

图2 放射学检查(X线)。(a)实验组第3周时X线片可见植入区有钙化影形成;(b)实验组第6周时X线片可见植入区有明显的钙化影形成Fig.2 The radioactivity inspection(X-ray).(a)the experimental group had calcification shade formation by X-ray at the 3rd week;(b)the experimental group had the obvious calcification shade formation around the implants at the 6th week

2.3.2 CT三维成像观察：对照组：3周与6周时该组所有大白鼠植入材料区域未见明显的点状或块状高密度影;实验组：3周时，可见轻微的点状或小块状高密度影，比正常的骨密度低，6周时，可见块状的高密度影，范围较3周时所见大，且骨密度较前观察时间点要高(见图3)。

2.4 组织学观察

苏木素-伊红染色，大体观，植入区域周围初期均表现为急性炎症反应，后期均为淋巴细胞、巨噬细胞浸润为主的非特异性炎症反应。第3周时，两组大白鼠植入区域周围炎症细胞浸润明显减轻，可见少量的淋巴细胞、巨噬细胞，毛细血管充血不明显。实验组可见植入区域周围间充质细胞开始向软骨细胞分化，分化成熟的软骨细胞可见，部分区域可见软骨岛和成骨细胞，对照组植入区域除可见炎症反应细胞外，还可见纤维性囊膜。第6周时，实验组植入区域周围可见软骨细胞、成骨细胞，并有编织骨和大量新骨形成，在其周围可见到新生血管。对照组可见巨噬细胞等分列在植入物与周围组织的界面上，纤维膜性结构增厚，未见软骨细胞与成骨细胞，其与肌肉组织分界较为清晰(见图4)。

图3 放射学检查(CT)。(a)实验组第3周时薄层CT扫描可见植入区有高密度影形成;(b)实验组第6周时薄层CT扫描可见植入区高密度影范围较前大Fig.3 The radioactivity inspection(CT).(a)the experimental group had high-density shade formation around the implants by CT at the 3rd week;(b)the experimental group had a bigger high-density shade by CT at the 6th week

3 讨论和结论

鼠尾胶原来源广泛，成分单一为Ⅰ型胶原，本身无毒性，生物相容性好，其降解产物在较短时间内可被机体吸收;同时冻干后鼠尾胶原支架的三维空间结构具有一定的强度以及适宜的孔径，保持了天然的渗透性，对细胞因子和细胞可以起到锚定和支持作用，为细胞增殖和功能分化提供合适的微环境，是构建组织工程支架的良好原料。鼠尾Ⅰ型胶原是骨组织的主要成分之一，是骨细胞外基质中最丰富的蛋白，其主要功能是作为组织支持物，赋与组织以张力;鼠尾Ⅰ型胶原也是骨组织细胞外基质的主要成分，可为成骨细胞提供支架，有利于成骨细胞和血管的迁移、长入[10]。鼠尾Ⅰ型胶原作为骨组织工程支架可以诱导成骨细胞的迁移和分化，其结构对矿物质沉积具有诱导作用，它的表面含有促进成骨细胞吸附、矿物质沉积的位点，可有效地增强矿化与成骨过程，使植入区肌肉组织生成新骨[11]。因鼠尾Ⅰ型胶原可为成骨细胞提供支架和促进基质矿化、钙盐沉积，相关实验表明鼠尾胶原冻干后孔隙率高，结构合理，更有利于成骨细胞的吸附与爬行修复。在本实验中鼠尾胶原作为支架材料复合BMP2活性多肽，植入大白鼠股四头肌内无免疫排斥反应，实验结果更具有科学性。

图4 组织学(HE染色)，实验组第6周时取材HE染色后可见有成骨细胞、软骨陷窝和新生骨形成。(a)200×;(b)400×Fig.4 Histological examination(HE). The experimental group had osteoblast and cartilage lacuna and new bone formation around the implants by histology observation(HE)at the 6th week.(a)200×;(b)400×

研究表明，BMPs诱导成骨的作用大致分为4个阶段：趋化期、分化期、骨质形成及重塑期。这个过程中间充质细胞在局部BMPs的刺激下发生化学趋向、聚集、分化形成软骨和骨，最后形成骨髓[12]。BMP2的主要生物学特性是刺激未分化的间充质细胞粘附，增值及定向分化，从而诱导新骨的形成。BMP2具有极强的诱导成骨能力[13-14]。虽然天然人BMP2成熟肽由114个氨基酸组成，但真正发挥骨诱导作用的只是由20余个氨基酸组成的核心结构域。本课题组就是根据BMP2的核心功能区域的氨基酸序列，用固相法合成BMP2活性多肽P24。其相对分子质量小，空间结构呈线状，活性位点易于暴露，功能发挥稳定。同时，P24小分子肽的应用，克服了全长BMP2序列中其它结构域引发的不必要的生物学效应。BMP2活性多肽是根据天然 BMP2具有诱导成骨功能的核心功能区设计合成的含24个氨基酸的寡肽，它包含磷酸化的丝氨酸以及天冬氨酸，能够极好地模拟天然骨基质的促发及指导矿化的功能，在局部形成偏酸的环境，促进局部的钙磷沉积、成核和生物自组装矿化[3，15]。同时，短链多肽活性位点能充分暴露并与细胞表面受体结合，生物活性更强，它在与鼠尾胶原材料复合过程中稳定性更好，复合后随着胶原的逐渐降解而释放，持续时间更长[15]。BMP2活性多肽与 BMP2一样具有生物学活性，它作为一种分子诱导信号，能通过特定的方式对细胞的黏附和向成骨方向定向分化等生物学行为进行精确的调控，有很好的骨诱导活性[12]。

本实验通过鼠尾Ⅰ型胶原作为BMP2活性多肽的载体植入大白鼠股四头肌肌袋后，可观察到植入区周围间质细胞向植入区积聚、分化、增生;间质细胞分化为幼稚的软骨细胞，并逐渐成熟，继而分化为成骨细胞与骨细胞，基质钙化，有力地证实了BMP2活性多肽的骨诱导活性与成骨作用，为下一步实验提供了较好的理论依据，如果能成功的运用于临床将为骨病患者带来福音。

鼠尾Ⅰ型胶原是一种较好的载体支架材料，自行研制合成的BMP2活性多肽与其复合后，具有较强的异位诱导成骨能力。

[1]Kim CS，Kim JI， Kim J， et al.Ectopic bone formation associated with recombinant human bone morphogenetic proteins-2 using absorbable collagen sponge and beta tricalcium phosphate as carriers[J].Biomaterials，2005，26： 2501-2507.

[2]Niu Xufeng，Feng Qingling，Wang Mingbo，et al.In vitro degradation and release behavior of porous poly(lactic acid)scaffolds containing chitosan microspheres as a carrier for BMP-2-derived synthetic peptide [J].Polym Degrad Stabil，2009，94：176-182.

[3]段智霞，郑启新，郭晓东，等.骨形成蛋白2活性多肽体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的剂量依赖性研究[J]. 中国修复重建外科杂志，2007，21：1118-1121.

[4]Saito N，Takaoka K.New synthetic biodegradable polymers as BMPcarriers for bone tissue engineering [J].Biomaterials，2003，24：2287-2293.

[5]Vailhe B，Vittet D，Feige JJ.In vitro models of vasculogenesis and angiogenesis[J].Lab Invest，2001，81(4)：439-452.

[6]Montanez E，Casaroli-Marano RP，Vilaro S，et al.Comparative study of tube assembly in three-dimensional collagen matrix and on Matrigel coats[J].Angiogenesis，2002，5(3)： 167-172.

[7]Bell E，Ivarsson B，Merribl C.Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro[J].Proc Natl Acad Sci USA，1979，76(3)：1274-1278.

[8]Schor SL，Schor AM，Winn B，et al.The use of threedimensional collagen gels for the study of tumour cell invasion in vitro：experimental parameters influencing cell migration into the gel matrix[J].Int J Cancer，1982，15;29(1)：57-62.

[9]Berthod F，Saintigny G，Chretien F，et al.Optimization of thinkness，pore size and mechanical properties of a biomaterial designed for deep burn coverage [J].Clin Mater，1994，15：259-265.

[10]Santin M，Motta A，Cannas M，et al.Changes in serum conditioning profiles of glutaraldehyde crosslinked collagen sponges after their threatment with calcification inhibition[J].J Biomed Res，1998，40(3)：434-441.

[11]Johnson KD，Frierson KE，Keller TS，et al.Porous ceramics as bone graft substitute in long bone defects[J].J Orthop Kes，1996，14：351-369.

[12]Kugimiya F，Kawaguchi H，Chung UI.BMP and bone formation[J].Clin Calcium，2004，14(1)：173-179.

[13]Wozney J，Seeherman H.Protein-based tissue engineering in bone and cartilage repair[J].Curr Opin Biotechnol，2004，15(5)：392-398.

[14]Boden SD.The ABCs of BMPs[J].Orthop Nurs，2005，24(1)：49-54.

[15]Geiger M，Li RH，Friess W.Collagen sponges for bone regeneration with rhBMP-2 [J].Adv Drug Deliv Rev，2003，55：1613-1629.