空肠弯曲菌flaA基因的原核表达及抗原性鉴定

王 婷,蒋 原,唐泰山,张常印,祝常青

(1.河南科技大学动物科技学院,河南 洛阳 471003;2.江苏出入境检验检疫局,江苏 南京 210095)

空肠弯曲菌是一种在世界范围广泛流行的常见的人畜共患病病原菌,大量存在于各种野生或家养动物的肠道内,引起牛和绵羊流产,雏鸡、犊牛、仔猪的腹泻等多种疾病[1]。空肠弯曲菌的抗原结构比较复杂,具有广泛的抗原多样性或差异性,目前已知有近60个血清型,且还有增加的趋势。空肠弯曲菌的菌体外膜上的抗原成分主要为蛋白质和脂多糖(O抗原)及鞭毛(H抗原)[2]。

鞭毛是空肠弯曲菌一个重要的毒力因子,鞭毛所提供的动力和粘附作用,可能参与细菌在细胞表面的吸附,以及其后的侵袭与定居过程,因而在其致病机制中起重要作用。鞭毛微丝由两个大小相近约为1.7 kbp高度同源的基因fla A和fla B编码,两者同源性为95%,目前有关鞭毛基因的研究多集中于fla A基因,fla A基因失活,空肠弯曲菌也将削弱细菌的毒力。有报道说鞭毛抗体可能是一种保护性抗体,因而鞭毛抗原是空肠弯曲菌疫苗的有力候选者[3]。

从空肠弯曲菌菌体中直接大量提取蛋白纯品较为困难和繁杂,在实际工作中难以被应用,而基因工程技术则为此提供了有利途径。由于空肠弯曲菌fla A基因(G+C)%含量低(36.4%),且与原核表达体系E.coli密码子兼并性较差,本试验根据已经发表的ATCC29428的基因序列,对 fla A基因进行了改造、表达,并分析了表达蛋白的抗原性。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒 空肠弯曲菌ATCC29428、大肠杆菌BL21(DE3),质粒pET-28a(+)由江苏出入境检验检疫局保存。

1.2 主要试剂及仪器 DL-2000 DNA Maker、TaKaRa Taq TM 试剂盒、低分子量蛋白Marker、Eco RⅠ、XhoⅠ限制性内切酶、T 4 DNA连接酶、TaKa Ra小量细菌质粒提取试剂盒、TaKaRa DNA快速纯化试剂盒均购于宝生物工程(大连)有限公司;IPTG、完全弗氏佐剂(CFA)及不完全弗氏佐剂(IFA):Sigm a公司产品分装,其余试剂均为国产分析纯。

PCR仪2400型:Bio-Rad公司;核酸电泳装置、垂直蛋白电泳装置:北京六一仪器厂;超声破碎仪:CPX600型,Cole Parmer产品;J2-21高速冷冻离心机:美国贝克曼公司。

ICR小鼠购自南京军区总医院实验动物中心,约10周龄,体重25～30 g。

1.3 fla A基因的改造和表达

1.3.1 fla A基因组的改造合成 根据GenBank已公布的空肠弯曲菌和ATCC29428 fla A基因测序结果,利用DNAStar软件进行同源性比较分析,利用VectorN TI软件进行基因组的改造,并添加酶切位点,送宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.3.2 重组质粒的构建与鉴定 在含30μg/mL Kan的LB液体培养基中接种含pET-28a(+)质粒的宿主菌 E.coli DH5α。37℃振摇过夜,按 TaKa-Ra小量质粒提取试剂盒说明书进行,提取的质粒。将提取的质粒用质粒8μL,10×buffer 2μL,Bam HⅠ1μL,Xho I 1μL,补 dd H2 O至 20μL的酶切体系37℃双酶切3 h酶切后的质粒经1%琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段和质粒,在紫外灯下将目的条带切下,用TaKaRa DNA快速纯化试剂盒回收凝胶中的目的条带,具体步骤按试剂盒说明书进行操作,回收产物用 T 4 DNA连接酶16℃连接过夜,以待转化。-20℃冻存备用。

参照《分子克隆实验指南》的方法[4],制备E.coli BL21(DE3)感受态细胞,将连接过夜的重组质粒转化,经卡那抗性筛选后挑取单菌落,进行酶切鉴定,将阳性克隆送宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.3.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达 将鉴定后的含重组质粒的细菌在LB培养基上挑取单菌落,接种LB培养基中(含Kan 30μg/m L),37℃振摇培养,当浓度达到OD6000.4～0.6时加入IPTG至终浓度1 mmol/L,37℃剧烈振摇培养6 h,分别于诱导后2、4、6 h取1.5 m L菌液,12000 g离心5 min,弃上清,沉淀用PBS洗涤两次,加入 100μL 1×蛋白上样缓冲液,煮沸5 min,12000 g离心5 min,取上清15μL,用 5%的浓缩胶和 12%分离胶进行SDS-PAGE电泳,分析蛋白条带。

1.3.4 重组蛋白表达形式分析及其纯化 收100 mL诱导培养4 h菌体,PBS洗涤2次,加20 m L超声破碎液(50 mmo L/L NaH2 PO4,300 mmol/L NaCl,p H8.0)重悬菌体,在冰浴中超声破碎细菌,功率为400 W,超声 5 s,停5 s,80个循环,超声两遍。于4℃12000 g离心10 min,回收上清,沉淀用1 m L PBS重悬。分别取12μL加3μL 5×SDS上样缓冲液后煮沸5～10 min,12%分离胶,5%浓缩胶进行SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。若蛋白存在于上清中时,取超声碎菌后的上清液 ,用Ni2+-N TA树脂层析柱亲和层析纯化,方法按说明书,分段收集洗脱液 ,进行SDS-PAGE电泳 ,分析纯化效果.纯化后依次加入3倍柱体积的去离子水去除EDTA,3倍柱体积的1×Strip Buffer洗柱,100 mmol/L EDTA储存柱。

1.4 重组蛋白抗原性试验 用小鼠抗空肠弯曲菌全菌血清以 Western blot检测纯化的重组蛋白FLA的免疫反应性;用纯化的FLA蛋白以PBS分别稀释至400μg/m L,加入等量的弗氏完全佐剂乳化(1∶1)后,背部皮下免疫 ICR小鼠,0.2 mL/只;2周后以弗氏不完全佐剂乳化(1∶1)进行二次免疫,4周后再加强免疫1次,同时设立 E.coli BL 21(DE3)-p ET 28a(+)-fla A未诱导灭活全菌免疫对照组和空白对照组。二次免疫后,每周采血分离血清,灭活空肠弯曲菌全菌包被,间接ELISA检测外周血中相应抗体的效价。

2 结果

2.1 fla A基因组的改造合成 根据空肠弯曲菌ATCC29428的基因序列和测序结果利用 Vector NTI软件进行基因组的改造,由宝生物工程(大连)有限公司测序合成 fla A(588 bp),改造后 fla A基因组与原基因组基因同源性为69.1%,(G+C)%含量为56.1%。

2.2 重组质粒的表达 将重组质粒p ET-28a(+)-fla A进行酶切和PCR扩增后,电泳可见588 bp特异性条带(图1),对鉴定正确的质粒,送宝生物工程(大连)有限公司测序,结果表明插入片段与预期结果完全一致。

2.3 重组质粒的表达 重组质粒p ET-28a(+)-fla A转化表达宿主菌E.coli BL 21(DE3),经 1 m mol/L IPTG诱导表达1～6 h后,通过 SDSPAGE考马斯亮蓝染色分析总细胞蛋白,可见特异性表达带(图2)。由图可知,用终浓度1 mmol/L IPTG诱导培养4 h后,表达量达到最大,占细菌蛋白总量的50%,相对分子量为25 k Da。

2.4 重组蛋白表达形式、纯化及反应原性鉴定将诱导菌超声破碎后 ,分别收集上清液和沉淀进行SDS-PAGE。上清液电泳后可见明显的特异性蛋白表达带 ,说明表达的重组蛋白以可溶性形式存在于胞质中。超声破碎上清液用 Ni2+-N TA树脂层析柱亲和层析后 ,用洗脱液洗脱吸附在Ni2+-N TA树脂上的蛋白质 ,收集洗脱液经SDS-PAGE(图3),Western bolt结果证实 ,小鼠抗空肠弯曲菌全菌抗体能与 FLA结合,FLA具有反应原性(图4)。

2.5 重组蛋白的免疫原性 经亲和层析柱层析获得纯化的重组蛋白FLA,浓度达到2.68 mg/m L,加佐剂免疫 ICR小鼠,6周后,用全菌包被的间接ELISA测的FLA免疫组血清效价为1∶25600,未诱导灭活全菌免疫组为1∶200(表1)。

表1 小鼠抗FLA血清ELISA效价的测定

3 讨论

由细菌纯化大量完整的目的蛋白十分困难,这势必影响蛋白的研究与利用。因此我们用E.coli原核表达系统对空肠弯曲菌可能的毒力因子FLA的基因片段进行克隆表达。

由于空肠弯曲菌(G+C)%含量低 fla A(36.4%),且与E.coli原核表达系统表达载体密码兼并性较差,不易于表达,试验中曾使用过p ET-32a(+)、pET-30、pGEX-6p-1多种载体及宿主菌,结果都不能表达,或表达量极低(＜10%)。根据测序结果利用Vector NTI软件进行基因组的改造,并添加酶切位点,用改造合成的序列 fla A构建了pET-28a(+)-fla A重组质粒,用其转化 E.coli BL 21(DE3)后 ,在 IPTG诱导下能高效表达分子量为25 k Da的目的蛋白FLA,由于质粒 p ET-28a(+)在多克隆位点上游有一段 H is-Tag和 T 7-Tag编码序列(分子量约为3.5 k Da)与蛋白融合表达,所以重组蛋白 FLA分子量与预计的理论值是相符的,蛋白表达量最大可达细菌总蛋白的50%左右,以纯化蛋白做Western bolt和小鼠免疫试验证明,该融合蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。

由于空肠弯曲菌的抗原成分较为复杂,除鞭毛蛋白外,主要外膜蛋白(MOMP)、趋化蛋白(CHEY)、粘附蛋白(PEB)、脂多糖(LPS)、细胞致死性毒素(CDT)等[5-9]在激活机体的免疫机制的过程中也具有重要的作用。目前对于这些蛋白的作用尚不明确,如能对其各个基因进行克隆表达,对功能进行充分研究,筛选出其具有免疫保护作用的表面抗原成分,并通过基因工程构建相应的疫苗[10],必将对空肠弯曲菌所致的食源性肠炎及继发的GBS等自身免疫性疾病的防治有极重要的意义。

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