高致病性PRRSV SC-JX01株Nsp2基因的序列分析和抗原表位预测

郭 杨,林 华,郭宇飞,郭万柱

(1.四川农业大学动物生物技术中心,四川雅安625014;2.四川出入境检验检疫局,四川成都610041;3.金陵科技学院动科院,江苏 南京 200038)

高致病性猪蓝耳病是由一种带有Nsp2部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的疫病[1-3]。猪是惟一的感染动物。本病没有明显的季节性,一年四季均可发生。主要发生在恶劣气候条件和饲养环境下。高度传播性、污染性是高致病性PRRSV的一个突出特征。与经典毒株相比,病原的基因序列变化主要是在Nsp2区缺失了30个氨基酸。故有学者认为病毒基因的缺失使其毒力明显增强,决定了其极强的致病性,经典毒对猪没有流行毒如此高的致死率[4-8]。

1 材料

主要仪器与试剂:质粒小量抽提试剂盒购自O-mega公司;高致病性 PRRSV SC-JX01株、SC-JX01株N sp2重组质粒均由四川农业大学动物生物技术中心保存并提供;高速冷冻离心机:法国Jouan公司;PCR试剂盒:博瑞克生物技术公司产品;DNA分子质量标准:均为TaKaRa公司(大连)产品。

2 试验方法

2.1 重组质粒的提取 将含有高致病性PRRSV Nsp2基因的重组质粒菌种接种于LB固体培养基,在平板上划线后于37℃恒温箱中培养12～16 h,挑取单个白色菌落接种于含Amp 100μg/m L的LB液体培养基中37℃振摇下培养过夜,至对数生长后期。参照质粒小量提取试剂盒说明书进行。

2.2 重组质粒的鉴定 用克隆N sp2基因的上下游引物(引物由林华提供),以重组质粒pMD-Nsp2为模板,进行阳性重组质粒的PCR鉴定。反应体系为50μL,反应程序为:95℃5 min;94℃1 min,56℃1 min,72℃1 min,35个循环;再 72℃7 min,取适量PCR产物电泳鉴定片段大小。挑取单个重组质粒菌株经培养送上海基康生物工程有限公司测序,并与参考序列比较。

2.3 Nsp2基因的序列分析 运用DNAStar软件对PRRSV不同毒株的Nsp2基因序列进行多序列比对并绘制遗传进化树。国内外的参考毒株为[9]:VR2332(A Y150564),16244B(NC-001961),Resp-PRRS MLV株(AF 066183),MLV Resp PRRS/Repro株(AF159149),LV株(M96262),CH1-a株(AY032626)、BJ-4 株(AF331831)、HB-1(sh)/2002株(AY150312)、HB-2(sh)/2002株(AY262352)。已发表的6个高致病性PRRSV毒株[10]为:JXA1株(EF112445)、HEB1株(EF 112447)、HUB2株(EF 112446)、SHH 株(EU 106888)、LN 株(EU 109502)、GD 株(EU 109503)。

2.4 利用DNAStar软件对SC-JX01株Nsp2基因推导编码蛋白质氨基酸序列进行亲水性、表面可能性和抗原性分析。

3 结果

3.1 重组质粒pMD-Nsp2的鉴定 以质粒DNA为模板,用Nsp2克隆引物扩增出约950 bp左右的条带,说明插入片段为目的片段。重组质粒提取成功。

3.2 SC-JX01株N sp2基因的序列分析

3.2.1 Nsp2基因的核苷酸序列分析 序列分析结果表明,N sp2基因序列与传统毒株相比缺失90个核苷酸。与国内分离的高致病性PRRSV毒株的Nsp2基因序列相似性很高为98.1%～99.1%(见图1);与美洲型标准株VR-2332、疫苗株MLV和早期国内分离的PRRSV经典株的相似性较低。系统发育树(见图2)分析表明,SC-JX01株Nsp2序列与国内分离的高致病性PRRSV毒株遗传距离很近,均属于PRRSV美洲株;与PRRSV欧洲型LV株的遗传距离较远。

3.2.2 Nsp2基因的推导的氨基酸序列分析 与普通PRRSV相比,本试验获得的Nsp2基因推导的氨基酸序列变异较大(见图3),不但存在点突变还存在缺失,共缺失 30个氨基酸。与国内高致病性PRRSV分离株 JXA1株、HEB1株、HUB2株、SHH株、LN株、GD株相比,缺失相同,仅存在少数点突变;SC-JX01株与6个变异毒株高度同源,相似性均大于95.5%,其中 SC-JX01株与 JXA1株、SHH株的相似性最高为98%;但与 VR-2332、MLV株等同源性则较低。

3.3 SC-JX01株Nsp2基因编码的氨基酸序列的亲水性、表面可能性及抗原性分析结果 通过对Nsp2基因编码的氨基酸的亲水性、表面可及性和抗原性指数进行预测,发现SC-JX01株Nsp2基因编码的氨基酸由于第534位～第562位发生缺失,造成亲水性区域比VR2332株宽,高抗原指数区域比VR2332株窄(图4)。序列分析发现,SC-JX01株Nsp2基因编码的氨基酸所表现的抗原性及其蛋白质表面的 可能性与其亲水性区域位点表现出一致的性质。

4 讨论

高志强[9]对国内毒株的序列比较结果表明Nsp2区的变异较大,我们选择扩增的这一区域在Nsp2序列中变异是最大的。此次分离的SC-JX01株Nsp2基因核苷酸序列中一处缺失3 bp;另一处连续缺失87 bp,与6个变异株的Nsp2基因序列高度相似,与早期分离的PRRSV毒株序列差异较大;在获得的SC-JX01株Nsp2基因推导编码氨基酸序列也存在2处缺失,这与童光志等[10]研究结果相似。

有学者认为以Nsp2基因的部分缺失为特征的PRRSV对猪是高致病性的[10-11]。从高热病中分离到的病毒,在Nsp2区域缺失30个氨基酸,同时该病毒引起的较高发病率、病死率,能直接通过Marc-145细胞进行病毒分离,提示Nsp2区域氨基酸的突变与缺失可能改变了PRRSV对细胞或组织的嗜性,或者Nsp2区域氨基酸的缺失与毒力增强有关系。

变异株的Nsp2基因编码的氨基酸由于第534位-第562位发生缺失,造成亲水性和抗原指数与VR2332株比较有非常大的变化。这使PRRSV变异株的致病能力大大加强,SC-JX01株和6个变异株序列特征高度一致,而与以前的毒株又有明显差异,尤其是N sp2基因的缺失和结构蛋白基因序列的突变,这些变化中哪些对毒力的改变起决定作用还有待进一步的研究[12]。

本研究对克隆的SC-JX01株Nsp2基因进行了序列测定,与美洲型标准株VR2332和变异株等相应序列比较分析,结果显示此次分离的SC-JX01株Nsp2基因与变6个异株Nsp2基因高度同源,与美洲型标准株VR2332等以前流行的经典型PRRSV Nsp2基因亲缘关系都较远,说明我国现在流行的PRRSV已发生较大的变异,这也可能是用传统的疫苗免疫无法抵抗高致病性(变异型)猪蓝耳病病毒的原因。

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