正交试验法优选清瘟败毒浸膏的提取工艺

汤法银,樊克锋,王海波

(1.郑州牧业工程高等专科学校药物工程系,河南郑州450011;2.河南省食品药品检验所,河南郑州450003)

清瘟败毒浸膏以2005年版《中国兽药典》收载“清瘟败毒散”为基础,进行加减化裁而得,其主要由金银花、黄芩、连翘、黄连、石膏等药组成,具有清热解毒、泻火除烦、凉血止痢、扶正祛邪之功效;用于治疗畜禽因各种病毒和细菌感染的混合型温热病。为了使该方更好的发挥药物疗效,最大限度的保留有效成分,现对其提取工艺进行研究,为该制剂最佳制备工艺的确立提供试验依据。

1 仪器与材料

美国产 Waters2695型高效液相色谱仪(EMPOWER色谱工作站);色谱柱为 DiamonsiL C18(5 μ m,200×4.6 mm);瑞士产 MET TLER TOLE DO AX205型电子天平;KQ-300超声波清洗器(江苏昆山仪器厂)。乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯,绿原酸对照品(批号:110753-200413,河南省药品检验所),水(重蒸水),金银花等药材(河南省药材总公司,经鉴定符合《中国兽药典》2005年版(二部)规定[1]。

2 方法与结果

2.1 提取工艺设计 选用 L9(34)正交表进行试验,以浸膏得率、绿原酸提取量为考察指标,考查水提取中3个加水量(A)、提取时间(B)和提取次数(C)3个因素,每个因素设3个水平,因素水平安排见表1。

2.2 浸膏的制备 按处方比例,称取适量金银花等药材9份,按正交条件分别进行煎煮,药液滤过,滤液浓缩并定量至3∶1(药材∶6浸膏),备用。

2.3 绿原酸的含量测定

表1 正交试验因素水平

2.3.1 色谱条件[1]流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液(13∶87);流速为1 mL/min;检测波长为327 nm;色谱柱为 DiamonsiLC18(5 μ m,200 ×4.6 mm);柱温:25℃;理论塔板数不低于2 000。此条件专属性强,峰纯度达到要求,见图1。按药典标准,测定原料药材金银花中绿原酸含量为1.83%。

2.3.2 对照品和供试品溶液的制备 对照品溶液:精密称取绿原酸对照品适量,置棕色量瓶中,加50%甲醇制成每毫升含25 μ g的溶液,即得。供试品溶液:精密称取浸膏0.5 g,置 50 mL量瓶中,加50%甲醇适量超声处理(功率250W,频率35 kHz)30 min,放冷后,加 50%甲醇至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μ m)过滤,取续滤液作为供试品溶液。

2.3.3 标准曲线 精密吸取对照品溶液2、4、6、8、10 μ L进样,以绿原酸进样量 (μ g)作横坐标(X),以绿原酸峰面积积分值为纵坐标(Y)绘制标准曲线(见图2),并对所测得的数据进行回归分析,回归方程为Y=1 404 871.20X-5 347.44,相关系数r=0.999 9,说明绿原酸在0.050～0.250 μ g范围内有良好的线性关系。

2.3.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液5 μ L,连续进样5次,在上述色谱条件下测定绿原酸对照品的峰面积,平均峰面积为175 602.5,RSD%=0.73%

2.3.5 稳定性试验 精密吸取供试品溶液5 μ L,分别于0、1、2、3、4 h 和 5 h 进样,测定供试品中绿原酸的峰面积,RSD%=1.16%,说明样品溶液在5 h内稳定。

2.3.6 重现性试验 精密称取同一批浸膏样品5份,按照供试品溶液制备项下方法制备供试品,各进样 5 μ L,测定绿原酸峰面积 ,RSD%=1.26%,说明重现性良好。

2.3.7 回收率试验 精密称取已知含量的浸膏样品6份各0.5 g,置50 mL容量瓶中,分别加入绿原酸对照品,按供试品溶液项制备供试品,进样5 μ L,测定绿原酸含量,计算回收率。结果平均回收率为99.84%,RSD%=1.07%。

2.3.8 样品测定 取正交试验的9份供试品液,分别精密吸取对照品和供试品溶液5 μ L进样,在上述色谱条件下测定,结果见表2,绿原酸提取方差分析见表3。

2.4 浸膏收率测定 精密称取浸膏1 g,置已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105℃干燥3 h,移置干燥器中,放置30 min,迅速精密称定重量,计算收膏率。结果见表2。

从绿原酸提取量指标来看,由直观分析可知,影响提取效果的因素顺序为:提取次数＞加水量＞提取时间,以提取次数影响最大,由此可推出的最佳工艺应为 A2B1C3。从浸膏得率指标来看,由直观分析可知,影响提取效果的因素顺序为:提取次数＞提取时间＞加水量,以提取次数影响最大。由此以可推出的最佳工艺应为A2B3C3。

以绿原酸提取量为主进行方差分析(见表3),加水量和提取时间对提取效果无显著性分析,提取次数有显著性影响。以绿原酸提取量指标为主要指标,浸膏得率指标为次要指标,故以确定最佳工艺A2B2C3,即煎煮3次,加8倍量水,时间1.5 h。

2.5 优选提取工艺的重复性试验 为进一步考察上述优选工艺的稳定性,按上述优化条件进行重复3次试验。结果见表4。

提取转移率计算:提取所用药材中,金银花中绿原酸含量为1.83%,1 g药材中标准含量应为18.30 mg绿原酸,而最佳工艺绿原酸平均提取量为11.18 mg,其提取转移率为11.18÷18.30×100%=61.05%。

3 讨论

清瘟败毒浸膏系中药复方制剂,成分复杂,绿原酸系本方中君药金银花发挥清热解毒功效的主要成分,因此选做质量控制的指标成分[2]。试验用正交设计法对清瘟败毒浸膏的提取工艺进行优选[3],除以测定绿原酸提取率为考核指标外,同时参考干膏的收得率,通过方差分析,水提该方影响绿原酸得率的主因素是提取次数,加水量及提取时间对其无显著性影响。最终,优选得出用8倍量水,煎煮3次,每次1.5 h为最佳提取工艺,经中试考察,该方法适合于大规模生产。

表2 正交试验结果

表3 绿原酸提取方差分析

表4 验证试验结果

[1]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典(二部)[M].北京:中国农业出版社,2006.

[2]孟日增,石建平,郭娜,等.金银花中绿原酸的提取工艺及抗菌活性研究[J].中国畜牧兽医,2007,34(11):144-145.

[3]尚立霞,王妮,刘妍妍.金银花提取工艺研究[J].食品与药品,2005,7:41-43.