嗅鞘细胞移植到损伤脊髓存活时间的研究

陈莉发,段朝霞,张洁元,李兵仓,余华荣

(1.重庆医科大学基础医学院生理教研室,重庆 400016;2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所第六研究室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042)

嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是一种特殊的胶质细胞,能促进嗅神经再生,引导无髓鞘嗅神经轴突从外周嗅粘膜上皮出发,穿过筛板,进入嗅球,使嗅神经终身具有再生性[1]。OECs分泌许多神经营养因子[2,3],如神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF),神经营养因-4/5(neurotrophin-4/5,NT-4/5)和神经调节蛋白(neuregulin,NRG)。OECs独特的生物学特性引起了众多学者的兴趣,目前,对OECs移植修复作用的研究颇多,但对其移植后存活的研究报道较少,或者结论不统一。本研究以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因大鼠为供体,观察其嗅球OECs植入挫伤脊髓后的存活情况,从而为其在移植修复中的作用提供细胞学参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 2.5月龄清洁级GFP转基因大鼠,体重(220±15)g.2.5月龄清洁级普通SD大鼠,体重(220±15)g(第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供)。所有动物的饲养和处理均按第三军医大学动物管理委员会的规定进行。

1.1.2 主要仪器设备、试剂 DMEM/F12培养基(GIBCO,美国);胎牛血清(FCS,GIBCO,美国);Forskolin(INVITROGEN,美国);碱性成纤维生长因子(bFGF,INVITROGEN,美国);多聚左旋赖氨酸(poly-l-lysine,SIGMA,美国);胰蛋白酶(GIBCO,美国);小鼠抗大鼠S100蛋白抗体(S100,武汉博士德);兔抗神经生长因子受体多克隆抗体(NGFR p75,武汉博士德);TRITC标记的山羊抗兔IgG(武汉博士德);FITC标记的山羊抗小鼠IgG(武汉博士德);Hoechst33342(SIGM A,美国)。NYU撞击机(美国);立体定位仪(ST-7,日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 OECs的原代培养 3%戊巴比妥钠致死剂量(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,断头,消毒后无菌环境下迅速取出GFP转基因大鼠双侧完整嗅球。剪去嗅球尾侧1/3,取头侧2/3置于4℃预冷的D-Hanks液中(青、链霉素各100 U/L)。用显微外科器械在解剖显微镜下仔细剥除包被嗅球的软脑膜及附着的毛细血管,沿纵轴方向剖开嗅球,剥除嗅球内部的白质层,将分离得到的外部灰质层,即嗅球纤维层和嗅小球层,用眼科弯剪剪碎至1 mm大小组织块,0.125%胰蛋白酶37℃消化20 min.巴氏滴管小心吸取消化后的组织块,移至加有3 ml DFF20(DMEM/F12/20%FCS)全培养液的培养皿中终止消化,5 min后,移至加有3 ml DFF20全培养液的离心管内,用经火焰抛光的巴氏滴管吹打15-20次,使组织块分散成单细胞悬液,静置5 min后收集上层细胞悬液。接种于包被多聚左旋赖氨酸(10 μ g/ml)的 6孔培养板内,置于37℃、5%CO2孵箱中培养。培养3 d后,用添加有Forskolin(100 mg/l)和bFGF(0.01 mg/l)的DFF20全培养液半量换液一次,以后每2-3天全量换液 1次。培养第10天,植入损伤脊髓。

1.2.2 GFP-OECs移植

制备GFP-OECs悬液:用酶消化法将培养10 d的 GFPOECs制成单细胞悬液,细胞浓度为 3×105个/μ l.

建立脊髓T10挫伤模型:取SD大鼠,3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于手术台,备皮,碘伏消毒皮肤,酒精脱碘,铺无菌巾,无菌条件下暴露脊髓T10节段,置于NYU撞击机固定,以10g、25mm致伤力挫伤脊髓。

移植GFP-OECs:将脊髓挫伤后的SD大鼠置于立体定位仪固定,用玻璃微电极吸取细胞悬液,注入损伤部位及其首尾侧各 1 mm 处,每处注射 1 μ l,共计 3 μ l,注射深度 1 mm,留针 1 min,随后缝合肌肉、皮肤各层,移植术后将动物分为两组:环孢菌素A组,移植术后每天腹腔注射环孢菌素A(cyclosporin,CsA)(10 mg/kg);非环孢菌素A组,术后未注射环孢菌素A.动物术后均与揉压排尿和抗感染护理,两组动物于移植术后1、2、4、8周麻醉后开胸暴露心脏,经主动脉灌注生理盐水200 ml,4%多聚甲醛400 ml,取出移植部位脊髓置相同固定液继续固定2 h,制作15μ m厚冰冻切片,于荧光倒置显微镜下观察GFP-OECs.

2 结果

2.1 非环孢菌素A组

此组动物移植术后 1、2周取材,制成冰冻切片,于荧光显微镜下损伤的脊髓处可见自发绿色荧光的OECs(图1A、B),移植术后4周,损伤的脊髓处未见绿色的OECs(图1C)。

2.2 环孢菌素A组

此组动物移植术后1周、2周、4周取材,制成冰冻切片,于荧光显微镜下损伤的脊髓处可见自发绿色荧光的OECs(图2A-C),移植术后8周,损伤的脊髓处未见绿色的OECs(图2D)。

3 讨论

GFP作为标记物,被广泛应用于细胞移植的研究领域,GFP转基因动物分离得到的细胞标记稳定,且不影响或很少影响细胞的正常功能,是细胞移植研究最为理想的工具[4]。本实验从GFP转基因动物分离得到自发绿色荧光的嗅鞘细胞,存活的嗅鞘细胞在蓝色荧光下呈肉眼可见的绿色,具有观察简单、避免假阳性等优点。

移植物存活时间一方面取决于移植物本身,另一方面取决于移植排斥反应的强弱。引起移植排斥反应的抗原称为移植抗原或组织相容性抗原,能引起强烈排斥反应的抗原称为主要组织相容性抗原(MHC抗原),供、受者间M HC型别差异是发生急性排斥反应的主要原因[5]。OECs高表达M HC-Ⅰ分子,中等表达MHC-Ⅱ分子[6],M HC分子与抗原肽形成抗原肽/MHC分子复合物供T细胞识别,活化的T细胞可直接杀伤表达异型抗原的移植物细胞,环孢菌素A是一种不溶性的真菌代谢产物,含有11个氨基酸的环状多肽,能有效地抑制T细胞介导的细胞免疫反应,使T细胞的扩增和分化受阻,环孢菌素A是一种抗有丝分裂和抗炎双重效应的高效免疫抑制剂。急性排斥反应一般在移植术后数天至2周左右出现,本实验未注射环孢菌素A组细胞存活时间只有2周,注射环孢菌素A组细胞移植后4周仍存活,说明OECs移植到脊髓存在排斥反应,而细胞移植后8周,未见绿色荧光的 OECs,说明 GFP-OECs死亡,不能表达绿色荧光蛋白。因此,OECs存活时间大于4周但小于8周,OECs移植后不能长期存活,避免给机体带来不良后果,比如“异位”占位,肿瘤等。

[1]Ramón-Cueto A,Avila J.Olfactory ensheathing glia:properties and function[J].Brain Res Bull,1998,46(3):175-187.

[2]Woodhall E,West AK,Chuah MI.Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor,brain-derived neurotrophic factor,glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors[J].Brain Res Mol Brain Res,2001,88(1-2):203-213.

[3]Lipson AC,Widenfalk J,Lindqvist E,et al.Neurotrophic properties of olfactory ensheathing glia[J].Exp Neurol,2003,180(2):167-171.

[4]Mothe AJ,Kulbatski I,van Bendegem RL,et al.Analysis of g reen fluorescent protein ex pression in transgenic rats for tracking transplanted neural stem/progenitor cells[J].J Histochem Cytochem,2005,53(10):1215-1226.

[5]龚非力.医学免疫学[M].第2版.北京:科学出版社,2004.

[6]梅爱农,朱鹏立,杨津,等.大鼠嗅鞘细胞免疫抗原分子检测[J].神经病与精神病学,2010,5(1):35-38.