阿霉素诱导非缺血性心肌病模型小鼠方法的建立及其可行性评价

黄楚珠，黄伟哲，梁结玲，肖大伟（汕头大学医学院第一附属医院，汕头市 515041）

阿霉素是蒽环类抗肿瘤药物，它能产生氧自由基而诱导心肌细胞凋亡，常被用于诱导非缺血性心肌病模型。目前国内、外多采用兔、大鼠[1]作为阿霉素的诱导对象，但由于采用这2种动物为对象具有体质量大、用药多、费用高、诱导心肌病模型的时间过长（一般8～12周）的缺点，为此，笔者采用小鼠作为诱导对象，必将节省大量费用。本研究通过一次性注射大剂量阿霉素的方式，短时间内建立小鼠非缺血性心肌病模型，并用高频率超声心动图评价其可行性。

1 材料

1.1 动物

BALB/c小鼠78只，♂，体质量22～24 g，周龄8～12周，由香港中文大学动物实验中心提供，动物实验合格证号：2005A018。

1.2 试药

阿霉素注射液（澳洲Ebewe公司，批号：406151，规格：2 mg·L－1）。

1.3 仪器

SONOS7500多普勒超声诊断仪（美国飞利浦公司）；AxioplanⅡimaging荧光相差倒置显微镜（德国Zeiss公司）；TECNAI10透射电子显微镜（荷兰飞利浦公司）。

2 方法

2.1 超声心动图检查

小鼠随机分为对照组和给药组，各39只。给药前所有小鼠均接受超声心动图检查，获取基础状态超声指标。给药组经腹腔一次性注射阿霉素20 mg·kg－1[2]，对照组注射同容量的生理盐水。2组在给药后第3、4、5天进行超声心动图检查，测定各项指标。超声检查前2～3 d重复训练清醒状态下的小鼠[3]。训练方法：左手捉鼠，右手将探头固定于小鼠左胸前壁，模仿超声过程，一般重复6～8次，直至小鼠心率稳定于540～650次·min－1，随后剔除左胸前壁鼠毛。实验超声检查由2人完成，一人捉鼠并固定探头，另一人操作机器。基础状态下和注射阿霉素后第3、4、5天检查小鼠，探头放置于左胸前壁，切取满意的左室长轴切面后，在乳头肌水平将M型取样线垂直于左室后壁而获得M型超声心动图，随即获取主动脉流速曲线。获取的超声图像传送至工作站保存，并由2位未参与试验的超声师行数据统计分析。选取3个连续心动周期，采用美国超声心动图协会推荐方法进行测量，测量数据包括：舒张末期左室内径（LVEDD）、收缩末期左室内径（LVESD）、心率（HR），左室收缩功能由左室短轴缩短率（FS）和每分钟输出量（CO）评价。HR由主动脉多普勒血流信号测量。FS和CO由以下公式 计 算 ：FS＝（LVEDD － LVESD）/LVEDD；CO＝HR ×（LVEDD3－LVESD3）。

2.2 组织学检查

超声检查完毕后在第5天处死所有小鼠，取心脏，称重，取左心室中上1/3切面，10%福尔马林液固定，石蜡包埋，5 μm切片，HE染色。于40×10倍荧光相差倒置显微镜下根据Billingham推荐方法评价每只小鼠心肌的病变程度[4]，即根据心肌胞浆空泡化和肌纤维丧失占所取切面的百分数进行评分，随后取各组评分的中位数：0分表示切面未见心肌胞浆空泡化和肌纤维丧失；1分表示心肌胞浆空泡化和肌纤维丧失占切面＜5%；1.5分表示心肌胞浆空泡化和肌纤维丧失占切面5%～15%；2.0分表示心肌胞浆空泡化和肌纤维丧失占切面16%～25%；2.5分表示心肌胞浆空泡化和肌纤维丧失占切面26%～35%；3分表示心肌胞浆空泡化和肌纤维丧失占切面＞35%。

2.3 电镜检查

取小鼠的左心室游离壁中上1/3心肌标本，放置4%戊二醛固定0.5 h，制作成体积约1 mm3的样本，送电镜室，用2%四氧化锇（pH 7.2），双重固定2 h，梯度丙酮（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15 min；100%丙酮2次，各10 min）脱水，环氧树酯包埋，半薄切片经甲苯胺蓝染色后，再行超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重电子染色。部分标本醋酸铀-柠檬酸铅双染色行透射电镜观察[5]。在透射电子显微镜下观察细胞核、线粒体、肌丝及新生的异常结构。

2.4 统计学处理

超声测量值以均数±标准差表示，2组间比较采用Student T-test，组织学病理评分以中位数表示，与心功能测量值关系采用Pearson相关分析。

3 结果

3.1 一般情况

对照组均存活，无异常改变，第5天称得心脏重量为（0.149±0.005）g。给药组小鼠普遍出现厌食、体质量下降、活动减少，第4、5天小鼠存活只数分别为36、30，第5天给药组小鼠心脏重量为（0.108±0.012）g，有显著性差异（P＜0.05）。

3.2 超声心动图检查结果

对照组在不同时间点的超声指标均稳定。给药组小鼠HR仅在第1天内有微弱升高趋势，随后下降，第3、4、5天均降低，与当天对照组比较有显著性差异（P＜0.05或（P＜0.01）。给药组FS在第3、4、5天呈下降趋势，第5天与当天对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。给药组CO在第4天即明显下降，与当天对照组比较有显著性差异（P＜0.05）；给药组LVEDD在第5天明显减少，与当天对照组比较有显著性差异（P＜0.01）。具体结果见表1（第0天n＝39；给药组第4天n＝36，第5天n＝30）。

表1 各组小鼠超声心动图检测结果（±s）Tab 1 Ultrasonic echocardiogram of each grou（p±s）

表1 各组小鼠超声心动图检测结果（±s）Tab 1 Ultrasonic echocardiogram of each grou（p±s）

与同一天对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.control group at the same day：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

参数HR/次·min－1 LVEDD/cm LVESD/cm FS/%CO/mL·min－1对照组给药组第0天579±15 0.294±0.014 0.126±0.015 56.7±4.3 13.2±3.0第3天585±11 0.284±0.022 0.123±0.017 56.4±3.6 12.1±3.4第4天581±14 0.286±0.018 0.131±0.022 54.2±4.5 11.3±2.8第5天580±17 0.294±0.013 0.128±0.017 56.5±3.9 12.5±2.5第0天586±23 0.298±0.019 0.128±0.020 57.0±3.9 13.3±2.7第3天567±31＊0.272±0.022 0.126±0.028 54.0±4.5 9.8±3.3第4天529±32＊0.253±0.047 0.126±0.031 50.2±5.6 7.5±2.3＊第5天478±30＊＊0.227±0.051＊＊0.125±0.036 44.3±6.1＊4.7±2.0＊

3.3 HE染色光镜检查

对照组胞浆丰富，肌纤维排列整齐；病理评分中位数均为0。给药组心肌损伤明显，细胞内空泡形成，肌纤维断裂、排列紊乱，细胞间隙水肿；第5天病理评分中位数为2.5。各组小鼠心肌细胞HE染色图见图1，给药组小鼠第5天病理评分见表2。

3.4 第5天电镜检查

对照组肌丝完整，线粒体未见异常；给药组可见肌丝排列紊乱，部分肌丝溶解，髓样结构形成，线粒体肿胀，线粒体嵴模糊。各组小鼠心肌细胞电镜检查图见图2。

4 讨论

阿霉素通过激活一氧化碳合成酶、结合三价铁和诱生过氧化氢等多种机制，促使心肌细胞内产生大量氧自由基，导致细胞凋亡[5]。注射20 mg·mL－1阿霉素后第24小时，即能发现Tunnel阳性的小鼠心肌凋亡细胞显著增多[6]。

本研究进一步显示，一次性腹腔注射20 mg·mL－1阿霉素，能在小鼠上建立稳定的非缺血性心肌病模型。组织病理切片示心肌纤维断裂、胞内空泡化，电镜下见线粒体肿胀、部分肌丝溶解，均属阿霉素心脏毒性的典型表现[7]。给药组的第5天心肌Billingham评分均在1.5分以上，证实阿霉素的心肌损伤充分、可靠；给药组的第4、5天小鼠存活数量足够接受检查。给药组小鼠FS减少，CO及心率下降，符合心功能不全的典型表现，与国外其它实验组的结果一致[8，9]。

高频率超声心动图能监测心肌病小鼠的心功能改变。本研究采用飞利浦公司提供的6～15 MHz线阵探头，检查频率设定为15 MHz，横向分辨率和纵向分辨率在理论上可达0.02、0.001 mm[10]，足以提供清晰的超声图象。此外，对照组在3、4、5 d测量的数值皆均匀一致，离散趋势小；相应给药组的心功能指标随时间变化逐渐偏低，符合病程变化，说明高频率超声心动图确能有效地评价该心肌病模型。

HR、CO、FS与相应的心肌病理评分相关系数依次为0.934（P＜0.001）、0.842（P＜0.001）、0.765（P＜0.01）。与CO 和FS比较，HR与组织学病理评分之间的相关系数最大，测量值变异系数最小，可见HR是评价心肌病模型的最敏感指标，追踪该模型HR的改变是必不可少的。第5天给药组各心功能指标均显著下降，电镜检查显示肌纤维内出现典型的阿霉素心肌毒性改变，说明给药后第5天心肌病模型已经成功建立。

本实验所测得的小鼠LVEDD减少，与长时间阿霉素诱导的扩张型心肌病表现不符，可能是小鼠心脏重量急剧减轻所致，该结果与其它实验组的结果一致[8]。

阿霉素短时间内能在小鼠上诱导出心肌病心衰模型，该模型具有经济、可靠、省时等优点，同时，使用高频率超声心动图评价该模型建立成功。

（致谢：本研究部分在香港中文大学儿科学系宋银子教授指导并帮助下完成，特致谢！）

表2 给药组小鼠第5天病理评分（n＝30）Tab 2 Pathologic scores of administration group on the fifth day（n＝30）

图1 各组小鼠心肌细胞HE染色图（10×40）A.对照组；B.给药组Fig 1HE staining of myocardium of each grou（p10×40）A.control group；B.administration group

图2 各组小鼠心肌细胞电镜检查图（×8 000）A.对照组；B.给药组Fig 2 Electron microgram of myocardium of each group（ ×8 000）A.control group；B.administration group

[1]Schwarz ER，Pollick C，Dow J，et al.A small animal model of non-ischemic cardiomyopathy and its evaluation by transthoracic echocardiography[J].Cardiovascular Research，1998，39（1）：216.

[2]Li K，Sung RY，Huang WZ.Thrombopoietin protects against in vitro and in vivo cardiotoxicity induced by doxorubicin[J].Circulation，2006，113（18）：2 211.

[3]黄伟哲，肖大伟，张保亭.比较麻醉和清醒状态对高频超声心动图评价小鼠心功能影响的研究[J].中华超声影像学杂志，2006，15（2）：128.

[4]Herman EH，Zhang J，Ferrans VJ.Comparison of the protective effects of desferrioxamine and ICRF-187 against doxorubicin-induced toxicity in spontaneously hypertensive rats[J].Cancer Chemother Pharmacol，1994，35（2）：93.

[5]Kalyanaraman B，Joseph J，Kalivendi S，et al.Doxorubicin-induced apoptosis：implications in cardiotoxicity[J].Mol Cell Biochem，2002，234（1）：119.

[6]Matoba S，Hwang PM，Nguyen T，et al.Evaluation of pulsed Doppler tissue velocity imaging for assessing systolic function of murine global heart failure[J].J Am Soc Echocardiogr，2005，18（2）：148.

[7]费洪文，王新房，周 诚，等.阿霉素诱导兔心肌病模型的建立及经胸超声心动图评价[J].中国超声医学杂志，2004，20（8）：572.

[8]Weinstein DM，Mihm MJ，Bauer JA.Cardiac peroxynitrite formation and left ventricular dysfunction following doxorubicin treatment in mice[J].Pharmacol Exp Ther，2000，294（1）：396.

[9]Sung R，Stephens M，Blayney L，et al.Cardiac hypertrophy and its regression in rat：comparison of morphological changes in response to aortic constriction，iron deficiency anaemia and isoprenaline[J].J Mol Cell Cardiol，1982，14（9）：501.

[10]Yang XP，Lin YH，Rhaleb NE.Echocardio-graphic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice[J].Am J Physiol，1999，277（5）：H 1 967.