青心酮防治动脉粥样硬化与内脂素的关系*

张代娟， 刘同美△， 崔晓栋， 刘江月， 郭军堂， 王建英， 叶笃筠

(1潍坊医学院病理生理教研室，山东 潍坊 261053;2华中科技大学同济医学院病理生理教研室，湖北 武汉 430030)

内脂素是在2005年发现的一种新的脂肪细胞因子(adipocytokines)［1］。目前认为，内脂素是一种重要的前炎症因子，内脂素在血管平滑肌细胞、内皮细胞皆有表达，在巨噬细胞、动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块富含脂质的区域高表达，在AS斑块不稳定性中发挥一定作用［2］，因此与AS的发生发展关系密切。我们前期工作观察到活血化瘀中药成分青心酮(3，4－dihydroxyaceto－phenone，DHAP)能通过抑制TLR4表达、TNF－α分泌起到较好的抗炎作用［3］。青心酮能否通过抑制内脂素分泌来影响AS炎症反应的发生发展，目前尚无这方面的报道。本实验拟对比青心酮及辛伐他汀对ApoE(－/－)小鼠内脂素分泌的影响，探讨青心酮对AS的防治机制。

材料和方法

1 仪器

ME1000+YG－2型电镜(USA)，Hoefer垂直型电泳槽和湿式电转膜槽(USA)，DF－C型电泳仪(东方特力科贸中心)，Bio－Rad型转膜仪(USA)，KD病理切片机(科迪仪器设备有限公司)，RX－2000全自动生化测定仪(Technicon)。

2 药品与试剂

青心酮为北京制药三厂赠送，批号为051202;辛伐他汀粉剂为浙江京新药业公司产品，批号为100601－200702;RT－PCR相关试剂购自Gibco－BRL。免疫印迹法相关试剂购自北京中山生物技术有限公司。免疫组化相关试剂购自晶美公司。

3 动物

C57BL/6小鼠、ApoE(－/－)小鼠，雄性，8周龄，清洁级，体重(18.14±0.70)g，购于协和医大实验动物中心，合格证号为scxk(京)2005－0013。

4 小鼠分组

取8只8周龄C57BL/6小鼠作为正常对照组;取24只8周龄雄性ApoE(－/－)小鼠，随机分成3组:动脉硬化组(n=8)，建立小鼠AS模型;青心酮治疗组(n=8)肌注青心酮 10 mg·kg－1·d－1;辛伐他汀治疗组(n=8)肌注辛伐他汀 10 mg·kg－1·d－1。药物剂量根据成人每天用药临床推荐的常用量换算［4］。所有实验小鼠均为清洁级别，同样温度、湿度和光照等环境条件下适应3 d，进食进水正常，体重稳定后开始进入实验程序。所有小鼠自由进食饮水，实验用药溶于生理盐水配成混悬液，根据当天动物体重给药;动脉硬化组肌注生理盐水。所有实验小鼠均饲以含脂肪21%，胆固醇0.15%的“西方类型膳食”饲料至12周。

5 实验取材

小鼠禁食过夜(不禁水)，称体重。经小鼠眼眶静脉丛采血，离心分离血清，测定血清内脂素、血脂。剪取主动脉根部靠近主动脉瓣环处约0.5 cm，用OCT组织固定液包埋固定，液氮速冻后置于－20℃冰箱保存，行冰冻切片，每个标本在显微镜下观察到完整的血管结构后继续切片10－16张，然后进行油红O染色，显微镜下观察血管壁脂质沉积、内膜增厚及斑块形成等病理改变。另取主动脉血管用2.5%戊二醛磷固定后环氧树脂618包埋，切片染色，电镜下观察血管平滑肌细胞、内皮细胞结构变化。

6 采用Western blotting法测定血浆、斑块中内脂素水平［5］

各组血样室温6000 r/min离心 10 min，取上清。SDS－PAGE(10%)电泳分离蛋白。将蛋白从电泳凝胶中转移到NC膜上。5%脱脂奶粉封闭30 min，Ⅰ抗37 ℃2 h，TBS冲洗 3×15 min，碱性磷酸酶标记Ⅱ抗37℃1 h，TBS冲洗4×15 min，NBT方法显色10 min，扫描分析。血浆总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL－C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL －C)、甘油三酯(triglycerides，TG)采用全自动生化分析仪测定。

7 统计学处理

用SPSS V13.0统计软件进行处理，数据以均数±标准差()表示，采用单因素方差分析，组间比较用LSD检验分析。

结 果

1 青心酮对ApoE(－/－)小鼠血清内脂素的影响

与对照组比较，动脉硬化组内脂素增高(P＜0.01)。青心酮组、辛伐他汀组与动脉硬化组相比均明显下降(P＜0.01)，但高于正常对照组(P＜0.01)，见表1、图1。

表1 青心酮对ApoE(－/－)小鼠血浆内脂素的影响Table 1.Effects of DHAP on plasma visfatin in ApoE(－/－)mice(.n=8)

表1 青心酮对ApoE(－/－)小鼠血浆内脂素的影响Table 1.Effects of DHAP on plasma visfatin in ApoE(－/－)mice(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs AS group.

Group Dose(mg·kg－1·d－1)The ratio of plasma visfatin to β－actin Control － 10.13 ±1.06 AS － 29.22 ±1.32＊＊AS+DHAP 10 14.01 ±0.97##AS+simvastatin 10 12.74 ±1.53##

Figure 1.Effects of DHAP and simvastatin on plasma visfatin in ApoE(－ /－ )mice.A:control group;B:AS group;C:AS+DHAP group;D:AS+simvastatin group.图1 青心酮对ApoE(－/－)小鼠血浆内脂素的影响

2 青心酮对ApoE(－/－)小鼠血浆TC、HDL－C、LDL－C、TG的影响

青心酮对ApoE(－/－)小鼠血脂有抑制作用。与对照组相比，动脉硬化组血脂均增加(P＜0.01)。青心酮组和辛伐他汀组中TC、TG较动脉硬化组下降(P ＜0.01)，但高于空白对照组(P ＜0.01);青心酮和辛伐他汀对HDL－C、LDL－C的影响与动脉硬化组相比无明显差异(P＞0.05)。青心酮组和辛伐他汀组之间无显著差异(P＞0.05)，见表2。

表2 青心酮、辛伐他汀对ApoE(－/－)小鼠TC、HDL－C、LDL－C、TG的影响Table 2.The effects of DHAP and simvastatin on plasma TC，HDL－C，LDL－C，TG in ApoE(－/－)mice(.n=8)

表2 青心酮、辛伐他汀对ApoE(－/－)小鼠TC、HDL－C、LDL－C、TG的影响Table 2.The effects of DHAP and simvastatin on plasma TC，HDL－C，LDL－C，TG in ApoE(－/－)mice(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs AS group.

Group Dose(mg·kg－1·d－1)TC(mmol·L－1) TG(mmol·L－1) HDL －C(mmol·L－1)LDL －C(mmol·L－1)Control － 2.53 ±0.45 1.50 ±0.23 1.60 ±0.25 1.33±0.20 AS － 24.38 ±1.36＊＊ 2.43 ±0.21＊＊ 3.76 ±0.24＊＊ 10.12 ±0.25＊＊AS+DHAP 10 14.72 ±2.30## 1.87 ±0.33## 3.55 ±0.32 9.23 ±0.21 AS+simvastatin 10 13.47 ±1.75## 1.58 ±0.27##3.64 ±0.26 9.47 ±0.28

3 主动脉根部病理改变

油红O染色可见，对照组仅在外膜有少量红染脂质，动脉硬化组血管切片中不仅可以看到红染脂质浸润，而且可以看到内膜增厚，并在多个血管切片上出现较大斑块形成，该组有4处斑块;青心酮治疗组血管切片可看到明显内膜增厚，但斑块数量较动脉硬化组减少，该组可见2处斑块;辛伐他汀治疗组内膜也有增厚，但较青心酮治疗组稍轻，有1处斑块形成，见图2。

4 青心酮对ApoE(－/－)小鼠斑块中内皮细胞、平滑肌细胞的影响

电镜观察对照组内皮细胞边缘清楚，细胞器结构正常，平滑肌细胞无迁移现象。与对照组比较，动脉硬化组内皮细胞空泡样变，线粒体髓样变，细胞质电子密度低;平滑肌细胞核不规则，内质网脱颗粒，纤维髓样变。青心酮组、辛伐他汀组有类似改变，但较动脉硬化组变化减轻，见图3。

5 青心酮对ApoE(－/－)小鼠动脉粥样硬化斑块中内脂素表达的影响

青心酮对ApoE(－/－)小鼠动脉粥样硬化斑块中内脂素表达有抑制作用。与动脉硬化组相比，青心酮组、辛伐他汀组均降低(P＜0.01)，但两者之间无显著差异(P ＞0.05)，见表3、图4。

Figure 2.Oil red O staining(×4).A:control group;B:AS group;C:AS+DHAP group;D:AS+simvastatin group.图2 各组小鼠主动脉根部横断面油红O染色病理切片

Figure 3.The effects of DHAP and simvastatin on vascular smooth muscle cells and endothelial cells at atherosclerosis plaque of ApoE(－ /－)mice(×7000).A:control group;B:AS group;C:AS+DHAP group;D:AS+simvastatin group.A －D:endothelial cells;E －H:vascular smooth muscle cells.图3 青心酮对ApoE(/－)小鼠斑块中内皮细胞、平滑肌细胞的影响

表3 青心酮对ApoE(－/－)小鼠动脉粥样硬化斑块中内脂素表达的影响Table 3.The effects of DHAP on visfatin at atherosclerosis plaque of ApoE(－/－)mice(.n=8)

表3 青心酮对ApoE(－/－)小鼠动脉粥样硬化斑块中内脂素表达的影响Table 3.The effects of DHAP on visfatin at atherosclerosis plaque of ApoE(－/－)mice(.n=8)

＊＊ P ＜0.01 vs AS group.

Group Dose(mg·kg－1·d－1)The ratio of visfatin to β－actin Control － 3.11 ±1.54 AS － 41.20 ±1.30 AS+DHAP 10 19.94 ±0.68＊＊AS+simvastatin 10 17.46 ±1.05＊＊

Figure 4.The effects of DHAP on visfatin at atherosclerosis plaque of ApoE(－ /－ )mice.A:control group;B:AS group;C:AS+DHAP group;D:AS+simvastatin group.图4 青心酮对ApoE(－/－)小鼠动脉粥样硬化斑块中内脂素表达的影响

讨 论

内脂素是在2005年发现的一种新的脂肪细胞因子(adipocytokines)［1］，又称前B细胞克隆增强因子(PBEF)，研究表明，内脂素具有类胰岛素作用，能够促进脂肪的合成与聚集，与2型糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖有关系［6，7］。现已证实:内脂素可通过和一些尚未确认的受体结合，剂量依赖性地上调单核细胞IL－1β、IL－1Ra、IL－6、IL－10和 TNF－α 水平［2，8］，可诱导血管内皮细胞 MCP －1 和 IL －6 的表达［9］，因此，内脂素是一种重要的前炎症因子，与AS的发生发展有密切联系，但是内脂素通过哪条途径影响AS发生发展，目前尚未明确。有研究表明内脂素可剂量依赖性增强人内皮细胞NF－κB活性，通过NF－κB通路介导基质金属蛋白酶2/9(MMP－2/9)、血管黏附分子、趋化因子等基因表达，促进血管性炎症反应的发生发展［10］。另外，内脂素还能诱导血管内皮细胞MCP－1和IL－6的表达［11］。

传统中药青心酮，又名3，4－二羟基苯乙酮(3，4－dihydroxyacetophenone，DHAP)，是从活血化瘀中药毛冬青根中提取的有效成分。青心酮具有较好的抗炎作用，与其下调TLR4、抑制TNF－α分泌、促进血红素氧合酶 －1(heme oxygenase－1，HO－1)/一氧化碳(carbon monoxide，CO)生成，及作用于环加氧酶－2(cyclooxygenase－2，COX －2)有关［3］。他汀类药除能有效降低胆固醇外，还可使斑块消退，进而减少冠心病临床事件的发生及降低心血管病死亡率［12］。

本实验中普通饲料喂养的ApoE(－/－)小鼠即可出现较严重的高脂血症，并容易在动脉壁形成动脉粥样硬化斑块，高脂饲养可加速动脉粥样硬化形成，且斑块的分布与人类动脉粥样硬化斑块的分布极为相似。本实验发现:青心酮亦能降低血脂水平，与辛伐他汀有相似的作用;青心酮和辛伐他汀皆能抑制ApoE(－/－)小鼠血浆内脂素的生成量及斑块中内脂素的分布，可能通过此途径减少斑块的形成及减轻病变的程度。

［1］Fukuhara A，Matsuda M，Nishizawa M，et al.Visfatin:a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin［J］.Science，2005，307(5708):426 －430.

［2］Curat CA，Wegner V，Sengenes C，et al.Macrophages in human visceral adipose tissue:increase accumulation in obesity and a source of resistin and visfatin［J］.Diabetologia，2006，49(4):744－747.

［3］张代娟，武少杰，刘同美，等.青心酮对RAW264.7细胞可溶性Toll样受体4表达及炎症相关因子的影响［J］.中国临床康复，2006，10(10):120 －122.

［4］徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学［M］.第3版.北京:人民卫生出版社，2002.202－204.

［5］J萨姆布鲁克，D W拉塞尔 著.黄培堂 译.分子克隆实验指南［M］.第3版.北京:科学出版社，2002.516－701，1713－1726.

［6］Dogru T，Sonmez A，Tasci I，et al.Plasma visfatin levels in patients with newly diagnosed and untreated type 2 diabetes mellitus and impaired glucose tolerance［J］.Diabetes Res Clin Pract，2007，76(1):24 －29.

［7］Berndt J，Kloting N，Kralisch S，et al.Plasma visfatin concentrations and fat depot－specific mRNA expression in humans［J］.Diabetes，2005，54(10):2911 －2916.

［8］Moschen AR，Kaser A，Enrich B，et al.Visfatin，an adipocytokine with proinflammatory and immunomodulating properties.［J］.J Immunol，2007，178(3):1748 － 1758.

［9］Liu SW，Qiao SB，Yuan JS，et al.Visfatin stimulates production of monocyte chemotactic protein－1 and interleukin － 6 in human vein umbilical endothelial cells［J］.Horm Metab Res，2008，65(13):653 －658.

［10］Adya R，Tan BK，Chen J，et al.Nuclear factor－ κB induction by visfatin in human vascular endothelial cells its role in MMP － 2/9 production and activation［J］.Diabetes Care，2008，31(4):758－760.

［11］Liu SW，Qiao SB，Yuan JS，et al.Visfatin stimulates production of monocyte chemotactic protein－1 and interleukin － 6 in human vein umbilical endothelial cells［J］.Horm Metab Res，2009，41(4):281 －286.

［12］Rosenson RS，Tangney CC.Antiatherothrombotic properties of statins:implications for cardiovascular event reduction［J］.JAMA，1998，279(20):1643 －1650.