噻唑橙-壳聚糖-叶酸靶向荧光探针的制备及性能研究

孟庆洋，费学宁，王义启

(天津城市建设学院 材料科学与工程系，天津 300384)

荧光染料是一种广泛使用的荧光标示剂(又称为荧光探针)，具有检测速度快、重复性好、用样量少、无辐射等优点．单体噻唑橙(TO)噁和 唑黄(YO)系列及其二聚体染料为典型的嵌入式探针，该种荧光探针染料对肿瘤细胞比对正常细胞更具亲和力，由于其标记速度快、接近生理 pH条件、对生物分子的功能活性影响小，因此已成为研究比较活跃的一类典型标记菁染料[1]．

近二十多年来，随着分子生物学的发展、免疫物质的化学研究与发展，以及对新药物资源的寻找与开发，对多糖的研究受到越来越广泛的重视[2-4]．壳聚糖[5-6](Chitosan，简称 CTS)是一种来源丰富、具有良好生物相容性及生物可降解性的天然高分子材料．由于壳聚糖分子内的羟基、氨基活泼性较强，因而容易对其进行化学改性；还可根据特定的对象选择合适的生物分子进行修饰，如修饰配体定位受体及修饰探针DNA、检测目标 DNA 等，为生物医学研究提供一种传统荧光检测的新方法[7]．因壳聚糖的存在，在配体与染料之间起到了一种桥梁的作用，并可增加染料的细胞相容性，降低毒性．同时，一个壳聚糖上接枝多个染料分子，在与组织结合和成像时所表现出的光学加合效应，对提高探针分子的灵敏度，降低使用量方面有积极意义．2005年，朝鲜Wonkwang大学的Kim等人[8]以半乳糖修饰的壳聚寡糖异硫氰荧光染料对肝细胞进行靶向成像，光学成像主要位于肝细胞．

叶酸作为靶向配体用于肿瘤靶向识别是近年备受关注的热点之一．叶酸是一种人体必需的 B组维生素，它在体内的主要转运途径是通过叶酸受体，特别是在多种上皮肿瘤组织，叶酸受体的表达量远远高于正常组织[9]，这是肿瘤组织快速增殖所必需的．已有研究显示，将壳聚糖与叶酸偶联，可作为 DNA 或RNA 的靶向载体[10-11]．

本文研究的目的是用壳聚糖修饰噻唑橙类衍生物，从而改善噻唑橙荧光染料的水溶性；同时通过偶联叶酸，特异识别叶酸受体过度表达的肿瘤细胞，实现肿瘤细胞靶向识别的作用．其合成路线如图1所示．

图1 TO-COOH-CTS-Folate反应示意图

1 实验部分

1.1 主要原料和仪器

所用试剂均为市售分析纯，薄层色谱所用硅胶(GF254型)为青岛海洋化工有限公司产品，荧光分光光度计为Cary Eclipase(美国瓦里安公司)生产，红外光谱仪 Nicolet380(美国热电集团)，差热分析仪为EXSTAR6000 TG/DTA差热质量分析仪(日本SEIKO公司)．

1.2 TO-COOH-CTS的制备

分别将 100 mg(0.19 mmol)TO-COOH、78 mg(0.38 mmol)N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、44 mg(0.38 mmol) N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和57 mg(0.57 mmol)的三乙胺加入 20 mL无水 DMSO中，室温搅拌至呈均相体系，然后加入30 mL甲醇，搅拌均匀，冷却至-5 ℃；向其中加入10 mL含有1 g CTS(相对分子质量＜3 000)的 1%醋酸水溶液．在氮气保护下，60 ℃加热搅拌反应．反应停止后，加入乙醚萃取，下层溶液用 100 mL丙酮沉淀，过滤，甲醇洗涤沉淀物，干燥，得到 500 mg的红色固体．其他条件的实验操作如上所述．

1.3 TO-COOH-CTS制备工艺的优化

1.3.1 TO和TO-CTS的紫外吸收及CTS修饰后TO相对量的确定

为确定CTS修饰后的TO的浓度与吸光度的定量关系，首先要确定TO与TO-CTS的相关性．采用紫外扫描光谱确定其相互关系，结果如图2所示．

由图2可知：TO与TO-CTS具有相同的紫外吸收特征，波形一致，说明CTS对 TO的紫外吸收没有产生影响，因此可通过 TO的紫外吸收强度与浓度的线性关系来确定CTS修饰后的染料中所含TO的相对量．

图2 荧光染料紫外吸收光谱

1.3.2 TO-COOH标准曲线的绘制

称取 TO-COOH 5 mg，置于 100 mL容量瓶中，用二甲基亚砜(DMSO)溶解并稀释到刻度；分别取10.0，6.0，5.0，4.0，3.0，2.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用 DMSO稀释到刻度，以 DMSO溶液为空白，用紫外分光光度计在 507 nm 处测定吸光度．以 TOCOOH浓度对吸光度做标准曲线．

1.3.3 偶联比的计算

取制得的TO-COOH-CTS 5 mg溶于水中，用水定溶至10 mL，然后在507 nm处测定紫外吸光度，计算每毫克CTS上偶联的TO-COOH毫克数．偶联比(GR)的计算公式为

式中：m为通过标准曲线折算出的 5 mg复合物中含有的TO-COOH的质量．

1.4 TO-COOH-CTS-Folate的合成

将叶酸 1.5 g(1.7 mmol)、DCC 1.4 g(3.4 mmol)、NHS 780 mg(3.4 mmol)和1 mL的三乙胺溶于70 mL无水DMSO中，避光过夜搅拌，直至叶酸溶解，过滤除去副产物；向其中加入40 mL含有360 mgTO-COOHCTS的水溶液，氮气保护，50 ℃加热搅拌 24 h；停止反应，过滤，滤饼用pH＝7.4的缓冲溶液洗涤，丙酮洗涤，干燥，得到400 mg红色固体．

2 结果与讨论

2.1 TO-COOH-CTS的结构表征

通过红外光谱(IR)和差热分析(DTA)，对制得的TO-COOH-CTS和 TO-COOH-CTS-Folate的结构进行表征．

2.1.1 TO-COOH-CTS的红外光谱

采用红外光谱对TO-COOH-CTS的结构进行表征，结果如图3所示．

图3 CTS、TO-CTS、TO的红外光谱

由图3可知：在 3 448 cm-1左右为壳聚寡糖中O—H基的伸缩振动峰和N—H基的伸缩振动峰重叠而成的多重吸收峰；在 1 643 cm-1左右为壳聚糖上氨基的特征吸收峰；在 1 519，1 470，1 547 cm-1左右为TO内的芳环骨架振动峰；在CTS和TO-COOH物理混合物(CTS＋TO-COOH)的红外谱图中也有以上特征峰；但 TO-COOH-CTS的红外光谱曲线中吸收峰1 504，1 464，1 550 cm-1为芳环骨架振动；在 754 cm-1处出现新的吸收峰，是六元环内氢键的骨架振动峰．

2.1.2 TO-COOH-CTS的差热分析谱图

采用差热分析对TO-COOH-CTS的结构进行表征，结果如图4所示．

图4 CTS、TO-CTS、TO的差热分析曲线

由图4可知：①CTS的热分解可分为二个阶段，第一步分解在 30～80 ℃，主要是脱去所带的部分水分；第二步是在200～400 ℃，在220 ℃左右出现一个小的吸热峰，当温度升至 280 ℃左右时出现大量放热，峰形变宽而高．②在TO-COOH的DTA曲线中，在 30～80 ℃范围内时，TO-COOH 脱水的吸热峰很小，在160 ℃左右和185 ℃又出现两个小的特征吸热峰．③接枝后的产物的DTA曲线明显不同于CTS和TO-COOH 的，其在 276 ℃左右时出现较强的放热峰，CTS放热峰在 283 ℃；而且在 185 ℃时 TOCOOH的特征吸热峰消失；同时，TO-COOH-CTS在229 ℃时出现了新的吸热峰．

结合图3和图4可知，CTS和TO-COOH不是简单的物理混合，壳聚糖已与羧基噻唑橙反应形成了复合物．

2.2 反应条件对偶联比的影响

根据 TO-COOH-CTS的制备条件，选择反应温度、反应时间、反应底物用量等对偶联比有影响的因素分别进行研究．

2.2.1 反应时间对偶联比的影响

保持原料投量和反应温度不变，改变反应时间，测定偶联比随反应时间变化的曲线，结果如图5所示．

图5 偶联比随时间的变化曲线

由图5可知：开始时，反应物浓度较大，反应进行的较快，所以偶联比随反应时间的延长先增加，当反应达到 5 h时，偶联比达到最大；继续延长反应时间，随着接枝链TO-COOH-CTS的不断增长，体系黏度变大，单体难以扩散到接枝活性中心，致使偶联比开始减小；当反应时间达 12 h后，反应速率减缓，偶联比趋于平稳．

2.2.2 反应温度对偶联比的影响

保持原料投量和反应时间不变，改变反应温度，测定偶联比随反应温度的变化曲线，结果如图6所示．

图6 偶联比随反应温度的变化曲线

由图6可知：此反应在室温条件下就可以进行，偶联比随温度升高先增大，当反应温度达到 95 ℃左右时，偶联比达到最大，随后趋于减小．这是因为温度升高时，单体运动能力增强，使 TO-COOH单体易于扩散至 CTS附近，有利于接枝；而温度过高时，反应体系不稳定，不利于反应进行．

2.2.3 CTS与TO-COOH的比例对偶联比的影响

保持反应时间和反应温度不变，改变投料比例，测定偶联比随CTS与TO-COOH的比例变化曲线，结果如图7所示．

图7 偶联比随CTS与TO-COOH比例的变化曲线

由图7可知：偶联比随着CTS与TO-COOH比例的减少而增加，当 CTS与 TO-COOH的摩尔比值小于 10∶1以后，接枝率的增加趋于平缓(CTS的分子质量按每个结构单元的 161 g/mol计算)．因为随着 TO-COOH比例的增加，TO-COOH的浓度相应增加，其扩散速度加快，偶联比增加；而随着反应进行程度的不断加深，体系黏度会增大，TO-COOH向接枝链的扩散受阻，从而使接枝链增加缓慢；当 TOCOOH的量增至一定值后，偶联比趋于一稳定值．综合考虑，以CTS与TO-COOH的摩尔比值等于10∶1为最佳．

2.3 TO-COOH-CTS的荧光分析

采用荧光光谱法对所制备的染料衍生物进行光谱测定，结果如图8所示．

图8 TO-COOH和TO-COOH-CTS的荧光光谱

由图8可知：相同 TO浓度的 TO-COOH-CTS与 TO-COOH相比，荧光最大发射波长无明显变化，而荧光强度明显增强，荧光量子效率也有明显的提高．这是因为TO-COOH-CTS中CTS部分的空间阻碍作用在一定程度上限制了 TO分子的旋转角度，改变了 TO分子的空间构象，进而使 TO-COOH-CTS的荧光强度发生变化．关于TO-COOH与CTS及细胞的多重相互作用关系正在研究中．

2.4 TO-COOH-CTS-Folate的红外光谱

采用红外光谱法对TO-COOH-CTS-Folate的结构进行表征，结果如图9所示．

图9 TO-COOH-CTS、Folate、TO-COOH-CTS-Folate的红外光谱

由图9可知：在 TO-COOH-CTS的红外光谱曲线中，1 504，1 464，1 550 cm-1处为芳环骨架振动，1 643 cm-1为 CTS上—NH2的弯曲振动吸收峰；叶酸的红外谱图中，3 415 cm-1左右为—OH和—NH2的伸缩振动峰，1 693 cm-1为羧基中 C＝O 的特征峰；在TO-COOH-CTS和叶酸的物理混合物(Folate＋TOCOOH-CTS)的红外谱图中也有以上特征峰，但在叶酸偶联TO-COOH-CTS的红外谱图中，在1 655 cm-1处新出现了一个酰胺键中 C＝O的特征峰；在3 420 cm-1左右的特征峰与叶酸相比有偏移现象，而且 TO-COOH-CTS-Folate中，叶酸羧基中 C＝O的特征峰也消失．以上区别说明了叶酸已与 TOCOOH-CTS反应形成了复合物．

2.5 TO-COOH-CTS-Folate的差热分析

采用差热分析对TO-COOH-CTS-Folate的结构进行表征，结果如图10所示．

由图10可知：在叶酸的DTA曲线中，在130 ℃左右的小峰是脱水的吸热峰，160 ℃左右为结晶水的吸热峰，193 ℃左右出现一特征吸热峰，当温度升至423 ℃时峰形变宽，为叶酸的特征吸热峰，温度升到442 ℃左右时出现放热，峰形变高而尖；在TO-CTS的曲线中，220 ℃时出现一特征吸热峰，在276 ℃左右时出现较强的放热峰，峰形高而宽；而接枝后的产物的曲线明显不同于叶酸和TO-COOH-CTS，其在295℃左右出现放热峰，且峰形变平缓，TO-CTS放热峰在277 ℃，峰形高而宽，而且在193 ℃处叶酸的特征吸热峰消失，在385 ℃左右出现宽而低的吸热峰，叶酸的放热峰在423 ℃左右．同时，TO-COOH-CTSFolate在465 ℃左右时出现了新的吸热峰．以上区别说明了叶酸和TO-COOH-CTS不是简单的物理混合，而是叶酸已与TO-COOH-CTS反应形成了复合物．

2.6 细胞标记的研究

用 TO-COOH、TO-COOH-CTS和 TO-COOHCTS-Folate对TJ905细胞标记24 h后的照片如图11所示．

由图11可知：TO在细胞核中表现出较好的荧光性能，但细胞质中没有荧光；TO-CTS在细胞膜和细胞核中均表现出了较好的荧光性能，TO-CTS在细胞染色过程中没有对细胞产生毒性，同时修饰后的染料可透过细胞膜进入细胞内部，表现出比 TO更强的荧光现象；TO-COOH-CTS-Folate与 TO的标记情况相似，同样在细胞核中表现出较好的荧光性能，而细胞质中没有荧光．

3 结 论

TO-COOH作为噻唑橙的一种衍生物，具有独特的荧光特性，将壳聚糖引入，对 TO进行修饰设计，合成了TO-COOH-CTS，其结构经过IR、DTA确认．荧光光谱研究表明，TO-COOH-CTS与 TO-COOH相比具有明显的荧光增强效应．将叶酸接枝到 TO-COOH-CTS 上，得到了 TO-COOH-CTS-Folate，细胞荧光标记实验表明，TO及其衍生物可以穿过细胞膜进入细胞内部，表现出强的荧光现象，并在细胞生理条件下稳定存在．关于TO与CTS及细胞的多重作用关系，以及叶酸对肿瘤细胞的靶向作用的研究尚在进行中．

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