微囊藻毒素检测方法改进和圆明园实际水样的测定

吴　溶，　崔莉凤，　张　冲，　卢　珊

(北京工商大学 化学与环境工程学院， 北京　100048)

水体富营养化不仅会引起水中藻类过度繁殖，影响景观效果，甚至会产生能引起鱼类、家畜甚至人类中毒死亡的藻毒素[1]. 天然水体中的藻毒素含量低、干扰大、检测困难，故对藻毒素提取分离进行研究具有重要意义. 其中微囊藻毒素(Microcystins,MC)是一种环状多肽，共轭双键在238 nm下能获得响应，故可通过紫外检测[2]. 由于自然界中MC常以痕量形式存在且干扰物质较多，需结合固相萃取浓缩富集后方能进行高效液相色谱法(HPLC)检测[3].

检测MC常采用HPLC,但使用的流动相及洗脱方式不同. 利用乙腈与水梯度洗脱可检出MC-LR(MC同分异构体之一，L、R分别代表亮氨酸和精氨酸)[4]. 但乙腈毒性大、价格高，考虑甲醇代替乙腈作为流动相,且甲醇是较理想的杂质和毒素洗脱液. 现有方法用20%甲醇淋洗，但对杂质较多样品效果不好[5]. 提取MC可采用超声、固相萃取法. 研究指出,MC浓度随超声时间的延长而增加[6]，也有实验显示超声10 min，提取率即可达较高水平[7]. 本研究以纯铜绿微囊藻为对象，比较藻毒素富集提取条件后建立分离、分析方法. 圆明园是北京重要景点之一，其水质问题一直备受关注，但是否含有MC未见报道. 本研究利用所建立的方法对圆明园水样进行藻毒素的测定、分析.

1　实验试剂与仪器

微囊藻毒素(MC-LR、MC-RR)标准样品、三氟乙酸(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，美国Fisher Scientific公司；Sep-pak C18小柱，美国Waters公司.

Waters-1505型高效液相色谱仪，美国Waters公司；KQ-400D型数控超声装置，昆山超声仪器有限公司；3-18K型高速冷冻离心机，Sartorius公司；循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；HH.SY11-Ni型电热恒温水浴锅，北京长风仪器公司.

纯铜绿微囊藻取自清华大学环境工程实验室，编号FAKHB915，镜检铜绿微囊藻纯度98%以上. 培养条件：环境温度28℃，光强4 500 lx，光暗比12∶12，M-11培养基.

2　实验方法

2.1　液相条件确定的方法

采用HPLC对藻毒素进行检测分析. 从流动相类型、配比、洗脱方式进行比较，分析其分离度、峰形等，找出最佳液相条件. 比较甲醇与水、甲醇与磷酸盐缓冲溶液作为流动相的效果及等度洗脱、梯度洗脱方式对检测藻毒素的影响. 其他固定的液相条件：色谱柱温度40℃,流速1 mL/min,检测器紫外可见波长238 nm.

2.2　提取方法的优化

取藻液、甲醇各10 mL，超声后4℃，10 000 r/min离心10 min. 上清液过0.45 μm滤膜后以3 mL/min的流速通过活化后的C18小柱，取10 mL淋洗液，10 mL蒸馏水淋洗以去除其中的杂质. 抽掉空气干燥2 min，10 mL洗脱液洗脱后60℃水浴蒸发至0.5～1.0 mL，甲醇定容至5 mL，-20 ℃保存待测.

1)超声时间的比较. 超声时间为10，20，30，40 min藻毒素的提取效果.

2)淋洗液浓度的分析. 富集后的MC水溶液用体积浓度为10%，20%，30%的甲醇淋洗，比较淋洗液中杂质、毒素及洗脱液中毒素的检出效果.

3)洗脱液浓度的研究. 比较体积分数为0.8，0.9，1.0的甲醇洗脱毒素的效果.

3　实验结果与分析

3.1　液相条件的确定

3.1.1流动相及流动相配比的确定

1)流动相为甲醇与水的混合. 比较以甲醇与水配比为80∶20；75∶25；70∶30；65∶35；60∶40；57∶43；50∶50作为流动相时液相色谱图，其中配比70∶30液相图如图1. 各配比条件下分离度如表1.

图1　甲醇与水70∶30作为流动相时液相色谱出峰时间1.099 min、1.739 min对应的是MC-RR、MC-LR. Fig.1　HPLC chromatogram when methanol:water is 70∶30The bulge time of 1.099 min、1.739 min is MC-RR、MC-LR.

表1　甲醇与水的不同配比下的分离度Tab.1　Separability of different proportion　methanol and water

由图1和表1可知，当流动相甲醇与水配比为70∶30时,MC-LR与MC-RR能较好分开且峰形较理想,而其他配比条件分离效果不理想，峰形也较差. 但由于甲醇与水配比为70∶30时分离度仅有1.423，小于1.5，不能达到要求，原因可能是色谱柱未经酸性改性，分离效果不理想. 文献[8]指出，在流动相中加入0.1%三氟乙酸或者磷酸盐缓冲溶液(pH=3)，可有效提高分离效果并优化峰形.

2)甲醇与磷酸盐缓冲溶液的混合. 由于甲醇与水作为流动相时分离效果不太理想，尝试用甲醇与磷酸盐缓冲溶液(pH=3)作为流动相. 其中甲醇∶磷酸盐缓冲溶液为57∶43的液相图如图2. 各配比条件下的分离度如表2.

图2　甲醇与磷酸盐缓冲溶液液相色谱出峰时间3.604 min、6.354 min对应的是MC-RR、MC-LR. Fig.2　HPLC chromatogram when used methanol and phosphate cushion solution The bulge time of 3.604 min、6.354 min is MC-RR、MC-LR.

表2　甲醇与磷酸盐缓冲溶液不同配比下的分离度Tab.2　Separability of different proportion methanol and phosphate cushion solution

由图2和表2看出，当甲醇与磷酸盐缓冲溶液配比为80∶20时， MC-LR与MC-RR并没完全分离. 根据单标样分析可知，MC-LR和MC-RR出峰时间相近，可能有部分峰重叠，分离效果不佳. 当甲醇与磷酸盐缓冲溶液配比为57∶43时,MC-LR与MC-RR能较好的分开，分离度达到最高4.532，且峰形较理想. 故使用甲醇与磷酸盐缓冲溶液57∶43作为流动相.

3.1.2洗脱方式的研究

选用等度、梯度洗脱两种方式分析. 梯度洗脱方式指流动相组成随时间变化而变化，可获得更好的分离度. 采用的梯度洗脱方法为0，10，35，40，45 min，甲醇∶磷酸盐缓冲溶液分别设定为40∶55,50∶50,60∶40,60∶40,45∶55，液相色谱如图3.

图3　梯度洗脱液相色谱出峰时间8.742 min、19.375 min对应的是MC-RR、MC-LR.Fig.3　HPLC chromatogram of grads elution The bulge time of 8.72 min、19.375 min is MC-RR、MC-LR.

由图3可见，梯度洗脱的分离度可达12.446，比等度洗脱时分离度大很多，分离效果更理想. 比较图2、图3可明显看出，等度洗脱MC出峰时间比梯度洗脱均早很多，且分离度也已达到要求，因此从时间与经济角度，选择等度洗脱方式较为理想.

3.1.3藻毒素检测方法的性能指标

1)线性范围和检出限. 称取微囊藻毒素标准品0.1 mg，100 μL甲醇溶解，纯水定容至10 mL，此标准储备溶液浓度为10 μg/mL，-20 ℃保存. 20%甲醇分别稀释至约0，0.5，1.0，2.0，2.5，5.0 μg/mL. 进样量20 μL，进样时间10 min. 按优化后的色谱条件得出MC-LR与MC-RR的标准曲线如图4.

按3倍信噪比计算检出限可达0.1 μg/mL，显示0.1～5.0 μg/mL范围内均有良好的线性.

2)准确度和精密度. 选用甲醇与磷酸盐缓冲溶液57∶43作为流动相，等度洗脱，柱温40 ℃，流速1 mL/min，紫外可见检测器238 nm. 重复实验以确定其性能指标. 具体数据如表3，其中准确度、精密度用相对误差、标准偏差表示.

3.2　提取方法的选择

纯铜绿微囊藻加入等量甲醇超声进行藻毒素的提取，超声后过0.45 μm滤膜后固相萃取富集，60 ℃水浴浓缩定容待测. 从超声时间、淋洗液及洗脱液浓度方面优化藻毒素的提取方法.

图4　微囊藻毒素标准曲线Fig.4　Standard curve of Microcystin

3.2.1超声时间的比较

环状结构的微囊藻毒素性质稳定，超声处理能破坏细胞结构，使胞内的藻毒素释放出来. 不同超声时间的藻毒素提取率如图5.

图5　不同超声时间的藻毒素提取率Fig.5　Extractions of different ultrasonic time

由图5可以看出，超声时间越长，MC的提取率越高，说明MC的提取效果随着超声时间的增长而提高. 当超声10 min后MC的提取率可高达84.51%. 30 min与40 min时提取率接近100%. 从而看出，超声达到30 min，藻毒素基本提取出来，故选择超声时间为30 min，不仅藻毒素提取效果较好，且较节约时间.

表3　藻毒素检测重复实验数据Tab.3　Determination result of Microcystin content

3.2.2淋洗液浓度的研究

收集不同浓度的淋洗液，检测其中的杂质和毒素. 其淋洗液液相色谱如图6至图8.

图6　10%甲醇淋洗液的液相色谱Fig.6　HPLC chromatogram of the 10% CH3OH elution

图7　20%甲醇淋洗液的液相色谱Fig.7　HPLC chromatogram of the 20% CH3OH elution

图8　30%甲醇淋洗液的液相色谱Fig.8　HPLC chromatogram of the 30% CH3OH elution

比较图6至图8不难发现，当30%甲醇淋洗时，有大量的藻毒素被洗脱下来，严重影响MC提取率. 当用10%和20%甲醇淋洗时，去除杂质效果均较好，且没有洗脱出藻毒素. 故淋洗液可选用10%或20%的甲醇.

收集不同淋洗液处理后的藻毒素洗脱液，液相色谱如图9至图11.

图9　10%甲醇洗脱液的液相色谱出峰时间6.491 min对应的是MC-LR. Fig.9　HPLC chromatogram of 10% CH3OH washtion The bule time of 6.491 min is MC-LR.

图10　20%甲醇洗脱液的液相色谱出峰时间6.481 min对应的是MC-LR. Fig.10　HPLC chromatogram of 20% CH3OH washtion The bulge time of 6.481 min is MC-LR.

图11　30%甲醇洗脱液的液相色谱Fig.11　HPLC chromatogram of 30% CH3OH washtion

由图9至图11可看出，当淋洗液浓度为30%时，洗脱液中并无藻毒素，杂质较多. 当淋洗液浓度为10%和20%时，洗脱液中杂质均较少，且明显前者的洗脱液中MC含量高于后者. 所以，选择淋洗液为10%的甲醇溶液更理想.

3.2.3洗脱液浓度的研究

不同浓度洗脱液的藻毒素提取率如图12.

图12　不同浓度洗脱液对藻毒素的提取率Fig.12　Extractions of different washtion concentration

图12表明，洗脱液浓度越高，MC提取率越高. 当洗脱液体积分数为1.0时，提取效果最好，可达93.86%. 故选择体积分数为1.0的甲醇溶液作为洗脱液.

3.3　实际水样MC检测

圆明园作为北京城区一个重要景观地区，水华问题较为严重. 尤其采用中水作为补充水源后，水中氮、磷含量较高，容易引发水华的暴发. 本研究利用选定的藻毒素提取检测方法，对圆明园海岳开襟景点的水样进行检测. 具体数据如表4.

表4　圆明园水样藻毒素检测结果Tab.4　Determination result of Microcystin content in Yuanmingyuan water　μg/L

表4数据显示部分水样可检测到MC，说明此方法适用于实际水样的测定. 圆明园水中藻毒素含量低于我国现颁布的生活饮用水水质卫生规范所要求的1 μg/L. 但比较各文献报道的各地MC含量[9-10]，其MC含量处于相对偏高的水平，可能是由于圆明园补给中水后，水中所含氮元素较高. 氮素是MC主要构成元素之一. 如MC-LR分子式为C49H74N10O12，氮含量为14%. 有研究表明，淡水中高含量的氮磷有助于产毒藻的生长和产毒[11]. 因此，圆明园水样中较高含量的氮元素可能促进藻毒素的产生，提高了水中MC的含量，具体机理有待进一步研究证实.

为研究本实验方法用于实际水样测量的可靠性，利用加标回收实验进行考察. 取一定量的实际水样，用本实验提取方法浓缩至1 mL，照本实验液相条件检测其中MC含量. 取1 mL藻毒素标准样品加到实际水样中，用同样方法测定加入标样后的水样所含MC含量，计算加标回收率. 加标回收进行两次做平行实验. 其中加标回收率= (加标试样测定值-试样测定值)÷加标量×100%. 其检测结果平均值如表5.

由表5看出,MC-LR、MC-RR的平均回收率都能达到90%以上. 表明所建立的提取检测方法可有效地检测实际水样中的藻毒素，且此方法数据可靠.

表5　加标回收实验检测值Tab.5　Determination result of join standard experiment

4　结　论

确定的藻毒素提取检测方法如下：水样超声30 min，经0.45 μm滤膜过滤，滤液通过活化后的Sep-pak C18小柱富集. 先用10%的甲醇溶液淋洗，再用100%甲醇洗脱藻毒素，最后浓缩定容待测. 藻毒素的检测采用HPLC，甲醇与磷酸盐缓冲溶液(pH=3)按57∶43混合作为流动相，等度洗脱分析MC. 此方法的准确度对于MC-RR及MC-LR分别达到1.06%、2.17%，MC-RR、MC-LR的精密度为1.35%、0.42%. 本方法较GB/T 20466—2006水中藻毒素的测定方法，不仅节省药品三氟乙酸的使用量，且在运行时间上得以缩短，大大减少检测成本.

将所确定的藻毒素提取检测方法应用于圆明园水样，部分水样可检测出MC，质量浓度为0.188～0.286 μg/L，加标回收率可达到90%以上，适用于实际水样的测定.