固定异养硝化-好氧反硝化菌脱氮能力的研究

王　磊，　汪　苹，　刘健楠，　尹明锐

(北京工商大学 化学与环境工程学院, 北京　100048)

固定化微生物技术主要有吸附法、载体结合法、交联法和包埋法等[7-8]，几种方法各有优缺点. 包埋法对微生物活性影响小、颗粒强度高，是目前研究最多的固定化方法[9]. 包埋材料主要为天然多糖类凝胶和合成高分子凝胶两类. 常见的天然高分子凝胶主要有：海藻酸钠、卡拉胶、琼脂等. 天然高分子载体一般对微生物无毒性,传质性能好,但强度低,厌氧条件下易被微生物分解,寿命短[9]. 合成高分子凝胶主要有：聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等[10]. 合成高分子凝胶载体抗微生物分解性好,机械强度高,化学稳定性好,但传质性能较差,在包埋细胞的过程中会降低细胞活性[10]. 目前，有研究者将合成的与天然的高分子凝胶联合使用，可弥补各自的缺点[11].

本研究拟采用单一包埋剂和混合包埋剂对WXZ-2菌包埋，通过对包埋小球菌体活性、机械强度、保存时间的考察，评价包埋效果，最终选出适合WXZ-2菌的包埋方法.

1　实验部分

1.1　实验材料及菌种

包埋剂：聚乙烯醇(PVA)(分析纯)、琼脂(分析纯)、卡拉胶(分析纯).

交联剂：硼酸(分析纯)、氯化钾(分析纯).

实验菌种：WXZ-2(实验室自筛)，经测定该菌种具有异养硝化和好氧反硝化性能. 经菌株鉴定为蜡状芽胞杆菌.

1.2　培养基

反硝化培养基(DM)(g/L)：柠檬酸三钠3.06，KNO30.722，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 1.0，调节初始pH为7.0.

硝化能力富集培养基(g/L)：(NH4)2SO4：0.47，KH2PO4：1.0，FeCl2·6H2O：1.25，CaCl2·7H2O：0.2，MgSO4·7H2O：1.0，柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)：5.1，碳源用量依据正交试验设计COD/N调节，并同时调节初始pH值.

异养硝化培养基(g/L)：(NH4)2SO4：0.47；柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)：5.1；KNO3:0.1；维氏盐溶液：50 mL.

维氏盐溶液(g/L)：K2HPO4：5.0；FeSO4·7H2O:0.05；NaCl：2.5；MgSO4·7H2O:2.5；MnSO4·4H2O：0.05.

1.3　实验仪器及设备

高压灭菌器、无菌操作台、紫外可见分光光度计、恒温水浴锅、恒温摇床、生化培养箱、冰箱.

1.4　实验方法

1.4.1菌种的增殖

将WXZ-2菌涂于营养琼脂上，增殖培养24 h，再将菌体转移到硝化能力富集培养基，增殖培养48 h.

菌液以8 000 r/min离心5 min，得湿菌体，用无菌水洗两次，放入冰箱待用.

1.4.2菌种的包埋方法

PVA法[12]：将PVA溶液45 mL(10%)与5 mL菌液(20%)混合，倒入饱和硼酸溶液，放入冰箱4 ℃交联12 h，取出，用无菌水洗净，切成3 mm见方的立方体，在生理盐水中浸泡，再放入4 ℃冰箱中待用.

PVA-琼脂法：将5%的聚乙烯醇和2.5%的琼脂混合液45 mL，与5 mL菌液(20%)混合. 混合液用10 mL一次性注射器滴入饱和硼酸溶液制得小球，放入冰箱4 ℃交联12 h，取出，用无菌水洗净，用生理盐水浸泡，放入4 ℃冰箱待用.

卡拉胶法[13-14]：将2.5%的卡拉胶溶液45 mL，与5 mL菌液(20%)混合. 混合液用10 mL一次性注射器滴入4%氯化钾溶液中制得小球，放入冰箱4 ℃交联12 h，取出，用无菌水洗净，用生理盐水浸泡，放入4 ℃冰箱待用.

PVA-卡拉胶[15-16]法：将5%的聚乙烯醇和1.5%的卡拉胶混合液45 mL，与5 mL菌液(20%)混合. 混合液用10 mL一次性注射器滴入饱和硼酸溶液和4%氯化钾混合溶液中制得小球，放入冰箱4 ℃交联12 h，取出，用无菌水洗净，生理盐水浸泡，放入4 ℃冰箱待用.

为方便下文论述，PVA小球、PVA-琼酯小球、卡拉胶小球、PVA-卡拉胶小球分别命名为a、b、c、d.

1.4.3包埋小球活性的测定

测定方法[17]：

1.4.4包埋固定化小球机械强度的表征[10]

将60个小球放入250 mL锥形瓶，加入100 mL去离子水,在恒温振荡器上300 r/min振荡12 h，完好的小球与原小球总数的比表示小球的强度系数[18].

1.4.5保存方法

烘箱干燥保存：将制备好的样品放入40 ℃鼓风干燥箱中，干燥至恒重，取出，放入自封袋中保存. 放入无水CaCl2作干燥剂.

2　实验结果与分析

2.1　包埋固定化小球的平均孔径及孔密度

通过电镜，测出4种小球平均孔径及孔密度，见表1. 理论上，孔径和孔密度越大，越有利于传质. 其中b小球孔径和孔密度最大，理论上传质效果最好.

表1　包埋小球孔径及孔密度Tab.1　Diameter and pore density of embedding ball

2.2　包埋固定化小球的脱氮效果

2.2.1不同包埋材料对菌种反硝化性能的影响

图1　小球的还原率随时间变化情况 reduction rate with time-varying of the balls

溶解氧和污染物的传质阻力是影响固定化小球反硝化能力的主要因素. 小球内部存在类似颗粒污泥的溶解氧梯度，因此可能会出现较低溶解氧的情况，这种条件更有利于反硝化反应的进行，所以包埋小球的反硝化能力并没有受到影响. 污染物传质能力的不同导致各种小球反硝化速率的不同.

2.2.2不同包埋材料对菌种硝化性能的影响

图2　小球的去除率随时间变化情况 reduction rate with time-varying　of the balls

图3为4种包埋小球TN去除率随时间的变化图，经24 h后取样，d小球的TN去除率与游离菌接近，达到60%，c小球和b小球的TN去除率只有50%左右，a小球最低. 48 h后，b小球的TN去除率超过其他样品并达到90.5%，而d小球TN去除率只有81.5%. 其他两种小球TN去除率仍然不高. 游离菌的TN去除率在72 h达到93.1%. b小球和d小球的去除率均有所下降，另两种小球虽然去除率有所升高，仍不到80%.

图3　小球的TN去除率随时间变化情况Fig.3　TN reduction rate with time-varying of the balls

通过包埋小球与游离菌的活性比较，4种小球的硝化能力都有不同程度的损失，但是包埋后菌种的硝化性能并没有改变.

2.3　转速对包埋菌种活性的影响

图4　a小球在不同转速下的及TN去除率 &TN reduction rate of a ball

图5　b小球在不同转速下的及TN去除率 &TN reduction rate of b ball

图6　c小球在不同转速下的及TN去除率 &TN reduction rate of c ball

图7　d小球在不同转速下的及TN去除率 &TN reduction rate of d ball

图8　游离菌在不同转速下的及TN去除率 &TN reduction rate of WXZ-2

2.4　包埋固定化小球的机械性能

机械强度关系到固定化小球的使用寿命，因此，研究固定化小球的机械强度就显得极为重要，实验数据见表2. 从表2可以看出，a小球和b小球都有很好的机械强度，没有任何破损，但是实验发现，a小球粘连现象非常严重，所有小球都粘在一起，严重影响了传质，而b小球无粘连现象. c小球实验破损率达到90%，剩余的小球也处于半融解状态；d小球破损率为10%，表现出较好的机械强度.

表2　4种小球的机械性能Tab.2　Mechanical properties of 4 balls

2.5　保存方法及时间对菌种活性的影响

图9　小球活性随保存时间的变化Fig.9　Active change following save time of balls以去除率表示菌种活性.

由于a小球包埋后菌种活性较低，c小球使用时破损率较高，因此它们未被选作进一步研究. 另两种小球均采用烘箱干燥保存，研究保存时间对包埋后菌种活性的影响，实验结果见图9. 由图9可以看出，随着保存时间的增加，活性均有所降低，保存90 d后，b小球和d小球活性分别为85.7%和81.2%. 两种小球活性下降不大，这是由于干燥固定化小球，使小球失水，小球表面的孔径变得很小甚至封闭，可以认为在小球内部给微生物提供一个隔氧、干燥、避光的环境，并且不会被杂菌污染，因此，两种小球都表现出比较好的存贮稳定性.

3　结　论

3) a小球和b小球机械强度最佳，c小球和d小球较差，a小球在制作过程中不易成球，使用过程中易粘连.

4) b小球和d小球经过90 d的干燥保存，其活性分别为85.7%和81.2%.