通脉大生片对肾虚排卵障碍型不孕大鼠 IGF-1及其受体影响的研究*

2010-07-12 08:29黄金珠方云芸傅春华成都中医药大学科技处成都611137
陕西中医 2010年9期
关键词:大生颗粒细胞通脉

黄金珠 方云芸 傅春华 成都中医药大学科技处(成都 611137)

通脉大生片是成都中医药大学第一附属医院用于妇科临床 50余年的重点院内制剂。该方来源于著名中医学家卓雨农老先生自制方“通脉大生丸”,由紫河车、肉苁蓉、杜仲等 17味中药组成 ,具有温肾填冲,调补气血,通畅脉络等作用,在肾虚、冲任虚损所致的排卵障碍、黄体功能不健的不孕症等方面取得较好的临床疗效。本实验主要研究通脉大生片对排卵障碍型大鼠的的胰岛素生长因子-1(IGF-1)及其受体(IGF-1R)的影响,以期证明用温肾填冲,调补气血,通畅脉络的中医方药对肾虚、冲任虚损所致的排卵障碍、黄体功能不健的不孕症有较好的临床价值。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物:健康 9日龄 SD系雌性大鼠,出生后母鼠哺乳至 22日龄断奶,专人饲养。利用自然光照,室温维持在 20~25℃ ,动物和饲料均由成都中医药大学实验动物中心提供,SD大鼠批号为:SCXK(川)2008-11。

1.1.2 试剂及仪器:丙酸睾丸酮注射液(规格:1m L:25mg)天津金耀氨基酸有限公司生产,国药准字 H12020531;通脉大生片(由杜仲、续断、桑寄生、肉苁蓉、紫河车、茯苓、山药等组成),规格:0.3g/粒,成都中医药大学院内制剂,川药制字Z20070648;枸橼酸氯米芬片 (规格:50mg/片)赛普路斯企业生产,进口药品注册证号:H20040352;大鼠胰岛素生长因子-1(IGF-1)酶联免疫分析试剂盒,批号:DEZ30653,由 RD公司提供;胰岛素生长因子-1R(IGF-1R)一抗 bs-0680R,由博奥森公司提供,IGF-1R二抗 sp-9001兔抗,由中杉金桥公司提供,批号:511783 A。可调式移液器:美国 PALL-Gelman公司;全自动多功能酶标仪 MK 3:芬兰雷勃。ILDZ4-018离心机:北京医用离心机厂。783643型光学显微镜为日本O LYMPUS公司生产;BI2004图像分析系统仪由成都泰盟科技有限公司提供。

1.2 方 法 1.2.1 模型复制及分组方法:应用SPSS13.0统计软件包产生的随机数字表,将 66只 9日龄 SD雌性大鼠随机分为空白对照组,模型组,通脉大生片高剂量组,通脉大生片中剂量组,通脉大生片低剂量组,克罗米芬对照组,共 6组。参照俞瑾等[1]研究方法,于实验组和模型组颈背部皮下注射丙酸睾丸酮 1.25mg/只 (0.05m L/只)。正常组在同等条件下饲养,未作特殊处理,第 22日龄断奶,利用自然光照,室温维持在 20℃左右 ,并由专人在同样条件饲养。第 70日龄(大鼠体重约 150g左右)阴道开口。连续阴道涂片 2个性周期(1个性周期为 5d),观察其阴道上皮细胞有无性周期变化,阴道上皮无性周期变化,则提示无排卵大鼠模型制作成功。

1.2.2 给药方法:从第 80d开始 ,各组分别按如下方法给药,按临床用药,以 60 kg人为标准,按照体重—剂量换算法计算大鼠给药剂量。模型组和正常组给 1m L(100g◦ d)生理盐水灌胃;通脉大生片高剂量组给予 0.12g/m L(100g◦ d)灌胃;通脉大生片中剂量组给予 0.06g/m L(100g◦ d)灌胃;通脉大生片低剂量组给予 0.03g/m L(100g◦ d)灌胃;克罗米芬组给予0.83mg/m L(100g◦ d)灌胃,每天灌胃 1次,连续灌胃 5周后股动脉取血处死大鼠。

1.2.3 检测方法:阴道脱落细胞检查:给药 25d后,对大鼠进行阴道涂片。将无菌棉签用生理盐水浸湿后轻轻插入大鼠阴道内,顺时针旋转 1圈充分沾取分泌物后,在载玻片上同方向轻轻滚动 3次,使分泌物均匀地涂布于载玻片上,待涂片自然晾干后,用 95%乙醇固定 15m in后,采用巴氏染色法,在显微镜下观察并判定其性周期,以判定造模的成功与否;连续灌胃 5周后,股动脉取血并处死大鼠,取出的血在室温下静置 2h后,用转速 3000转/分离心 10min取其上清液,用酶联免疫法检测血清中 IGF-1的浓度,取出卵巢,小心剔除脂肪组织,并包埋、切片,用免疫组化检测卵巢中 IGF-1R,剔除脱片,组织重叠,切到脂肪组织及输卵管的切片,在 400倍电镜下采用同一光线,每系统分析其积分光密度。病理切片用 HE染色,在 100倍光镜下观察其形态学变化。

1.2.4 统计学方法:应用 SPSS 13.0统计软件分析,多样本之间均数比较采用单因素方差分析(one way ANOVA),用±s表示。

2 结 果 2.1 对卵巢的病理形态学观察结果 镜下模型组卵巢苍白,表面见卵泡,但卵泡多呈囊性扩张,卵泡内含大量浆液性物质,间质过度增生,有大量闭锁卵泡和原始卵泡存在,无成熟卵泡,卵泡较小,无黄体;给药组卵巢色泽鲜红,与模型组比较,病理性囊性卵泡明显减少,卵泡壁颗粒细胞排列较密,层次增多,有少量成熟卵泡和黄体生成;正常组卵巢色泽红润,卵泡发育良好,无病理性囊性卵泡,有成熟卵泡,表面见较多黄体。

2.2 各组间 IGF-1水平比较

表1 各组间 IGF-1水平统计结果比较

2.3 各组间 IGF-1R表达结果比较

表2 各组间 IGF-1R表达统计结果比较

3 讨 论中医认为排卵障碍以肾虚为关键,内经云“肾藏精,主生殖,为先天之本”。卵子是肾所藏之“阴精”,肾阴是其物质基础,肾阳是其生长的动力。肾精充盛是卵子发育成熟的前提,肾阳保障肾在排卵前只合不开,发挥主蛰与主闭藏之功能,使肾藏精而不泄,肾精充盛,卵子发育成熟,阳气主动,肾阳的鼓动使冲任气血调畅,卵子正常排出。若肾精不足、肾阳亏虚,一方面当合不合,卵泡不能发育成熟,另一方面,当开不开,不能作为内在动力鼓动卵子排出,从而出现卵子排出障碍。行,冲任脉络不畅,阻滞胞宫胞脉,也会导致卵子排出受阻。故卵子的发育成熟及排出与肾精充盛、肾阳鼓动密切相关。故中医治疗常以补肾为主,兼调补冲任气血,效果显著。

而通脉大生片是由杜仲、续断、桑寄生、肉苁蓉、紫河车、茯苓、山药、枸杞、首乌、台乌、当归、荔枝核、车前仁等十七味中药组成,方中用紫河车、肉苁蓉、杜仲、续断温补肾阳,血肉有情之品直入下焦 ,填奇经之精,补奇经之气;配以枸杞子、首乌、当归养肝阴,补益奇经之血;辅以山药、茯苓、车前仁、桑寄生健脾利湿,调理脾胃,当归、台乌、荔枝核活血行气,通其脉络 ,共奏通补之效。全方具有温肾填冲,调补气血,通畅脉络的作用。

现代研究发现卵巢排卵,既受下丘脑-垂体-卵巢轴的调控,也受卵巢局部微环境特别是非固醇网络的调控,即卵巢的自分泌-旁分泌系统在卵巢局部发挥微调节作用。参与这一过程的自分泌和旁分泌因子很多,其中胰岛素生长因子-1(IGF-1)已被证实参与卵巢的局部调节[2-4]。

自从 1978年 Rinderknek t和 Humbel首先纯化 IGF-1和IGF-2后 ,人们发现卵巢可以产生 IGFs,而 IGFs可以独立或协同促性腺激素调节卵巢周期性优势卵泡选择、排卵、性激素合成等。目前研究认为介导胰岛素生长因子家族的生理功能的主要是 IGF-1和 IGF-1R发挥的[5,6],且 IGF-1是卵巢局部调节系统中重要的生长因子[7-8],IGF-1除可刺激黄体颗粒细胞产生E2和 P,还可以协同 LH进一步促进雄激素的合成和分泌,使雄激素水平升高[9]。因此,卵巢内 IGF-1的过度表达,可导致雄激素合成过多,进而导致卵泡过早发育、卵泡膜过度增生,成为不易破裂的囊泡,进而影响卵泡的成熟和排卵。IGF-1R在卵巢颗粒细胞、卵泡膜细胞和黄体细胞中均含有。原位杂交表明,IGF-1Rm RNA主要在颗粒细胞和卵母细胞中表达。在大鼠中,经 IGF-1处理培养的大鼠颗粒细胞能够提高 1型 IGF受体的表达[10]。 IGF-1的大部分细胞效应通过 IGF-1R实现[11]。

本研究发现模型组血清内 IGF-1水平以及卵巢局部 IGF-1R的表达明显高于正常组。该结果提示 IGF-1/IGF-1R过高可以导致排卵障碍,而通过给药,高剂量通脉大生片可降低大鼠血清内 IGF-1水平和卵巢局部 IGF-1R表达,低剂量通脉大生片可降低 IGF-1R的表达。说明通脉大生片可以通过降低 IGF-1/IGF-1R促进卵泡的生长发育和排出。而克罗米芬并不能降低血清 IGF-1水平和卵巢局部 IGF-1R的表达,提示克罗米芬促排卵的机制可能不是通过调节 IGF-1/IGF-1R起作用的。同时,在本实验中发现中剂量通脉大生片对过高的 IGF-1/IGF-1R不敏感,考虑可能与给药浓度、样本量、给药时间等因素有关。而通脉大生片是如何达到降低 IGF-1/IGF-1R,是通过性腺轴,还是有其它因子的参与,需进一步深入研究。

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