一种筛选染料脱色真菌的新方法——脱色圈法

魏宝阳，贺龙泽，龚思齐，李金龙

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；2.长郡中学，湖南长沙410000；3.湖南农业大学东方科技学院，湖南 长沙410128）

据国家环保总局对我国水环境污染现状的统计与调查，我国的江河、湖泊及近海流域已普遍受到不同程度的污染，造成污染加重的主要因素是工业废水和生活污水的排放，水污染已经成为严重的社会问题[1]。纺织印染工业是现代工业中对环境造成严重污染的产业之一[2]。据不完全统计，纺织印染业废水排放量居全国工业行业第5位，其废水排放总量为14.13亿t，每年占全国工业废水统计排放量7.5%[3]。印染废水具有水量大、有机污染物含量高、碱度高、色度高、生物降解难、水质变化大等特点，属难处理的工业废水之一[4]，印染废水的脱色处理成为了印染废水治理的关键环节[5-6]。研究表明，对印染废水起脱色作用的微生物主要有真菌、细菌和藻类3种。近年来，有脱色能力的微生物被广泛发现并利用[7]，如细菌中的假单胞杆菌（Pseudomonas），藻类中的普通小球藻（Chlorella valgaris）、蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），真菌中的黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等[5]。为此，笔者设计了一种从土壤中分离筛选印染废水处理用微生物的新方法——脱色圈法，旨在筛选对染料有明显脱色能力的真菌，为处理印染废水提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

土壤来源：造纸废水和生活污水等排入浏阳河的主入口处河岸的土壤。

1.2 试验仪器

TOMY自动立式灭菌锅 SS-323（TOMY KDGYOCO.,LTD），超净工作台（苏州净化设备有限公司），MJX-160型霉菌培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），SYC-L1型恒温摇床（上海联环生物工程设备有限公司），WF J 7200型可见光分光光度计[尤尼科（上海）仪器有限公司]，UV－2100双光束紫外可见光分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司），DHG-9070型电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），D2F-6050型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），OLYMPUS BX41TF荧光显微镜（OLYMPUS CORPORATION TOKYO,JAPAN）。

1.3 培养基的配制

培养基的配制方法参考沈萍等[8]，选用改良马丁氏培养基：葡萄糖10 g/L，NH4NO32 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，固体培养基加入琼脂20 g/L，pH自然，TOMY自动立式灭菌锅 121℃、20 min灭菌，自然冷却至室温备用。

染料-改良马丁氏培养基：改良马丁氏培养基消毒灭菌、冷却至适温（65～75℃），加入经过滤灭菌处理的一定浓度的孟加拉红、亚甲基蓝、藏花红、结晶紫、孔雀绿。

染料-PDA培养基：PDA培养基消毒灭菌，冷却至适温，分别加入灭菌处理的一定浓度的孟加拉红、结晶紫、藏花红、伊红丫橙、孔雀绿和亚甲基蓝。

1.4 试验方法

1.4.1 土壤微生物的分离与筛选 采用常规的“10倍稀释法”：用无菌纸称取土样10 g，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的250 mL三角瓶中，振摇30 min、静置30 min，获得土壤悬液。用1 mL移液管吸取1 mL土壤悬液，注入盛有9 mL无菌水的试管中，充分混匀，得到第一个稀释液（10-1）；然后，另取一只1 mL移液管吸取1 mL第一稀释液，注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，摇匀，得第二稀释液（10-2），依此类推制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。以上所用三角瓶、试管及1 mL移液管均已灭菌处理。分别取10-4、10-5、10-63个稀释度的土壤悬液0.1 mL，涂布于含0.3%的孟加拉红-改良马丁氏培养基平板（每个稀释度设3个重复），培养皿倒置，30℃培养48 h，对平板培养基上菌落进行初步分离、筛选，得到单菌株。

筛选具有脱色圈的菌落，脱色能力的强弱可以通过以下公式做初步判断：Hc=R1/R2，其中R1为脱色透明圈的直径，R2为菌落的直径，Hc越大的菌初步认为脱色能力越强。

1.4.2 黑曲霉固体培养条件下的脱色能力测试接种环点接斜面菌种于染料-PDA培养基平板中央，30℃培养72 h。染料有孟加拉红、结晶紫、藏花红、伊红丫橙、孔雀绿和亚甲基蓝，每种染料3次重复。

1.4.3 黑曲霉液体培养条件下的脱色能力测试染料—马丁氏液体培养基接种0.1 mL孢子悬浮液，150 r/min，30℃振荡培养48 h。其中染料分别为孟加拉红、亚甲基蓝、藏花红、结晶紫、孔雀绿，每种染料3次重复。称量菌体干重，并对脱色后的溶液用可见光分光光度计测出最大吸收波长处的OD值，以不接种菌体的染料溶液初始OD值为对照，计算脱色率。以脱色率表示菌株对染料的脱色能力[10]。

脱色率=（A-B）/A×100%（A：脱色前染料在最大吸收波长处的OD值；B：脱色后染料溶液在最大吸收波长处的OD值。）

2 结果与分析

2.1 菌种分离、筛选及鉴定

将 10-4、10-5、10-63个稀释度的土壤悬液，分别涂布于孟加拉红-改良马丁氏培养基平板，30℃培养48 h后，平板中有的菌落周围出现了脱色后的透明圈，说明这些菌落可能对染料有脱色作用。对这些菌落进行初步分离筛选得到单菌株（见图1）；其后，挑取少量菌株，纯化后接入斜面保藏培养基（改良马丁氏培养基），30℃培养、扩繁保存，供后续试验使用（见图2）。

图1 脱色菌初筛结果

图2 纯化后菌落脱色圈

根据叶世泰等[11]提供的形态指标，初步鉴定该菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）；经孟加拉红-改良马丁氏培养基平板的初步检测，黑曲霉菌株生存能力较强，适应抑菌能力较强的色素培养基环境，推测其具有较强的脱色能力。

2.2 黑曲霉固体培养条件下的脱色能力

培养72 h后，各平板出现了不同程度的脱色和抑菌现象，具体见表1。

表1 脱色谱初步测试结果

抑制菌体生长中，结晶紫与伊红丫橙接近，72 h后抑菌率均为78.6%；而孔雀绿培养基的抑菌率高达为97.1%。72 h后，孟加拉红、藏花红和亚甲基蓝的脱色圈很明显。由此可知，不同的色素对菌体的毒害作用不同，除部分色素对该菌有较强的抑制作用外，色素的毒害作用不大；且黑曲霉的脱色谱较广，在色素培养基中的适应能力也较强，说明该菌有一定的应用价值。

2.3 黑曲霉液体培养条件下的脱色能力

孟加拉红、亚甲基蓝、藏花红和结晶紫等染料—马丁氏液体培养基培养96 h后，分别于546、664和560 nm下测量滤液的OD值，并计算脱色率，结果见图3。

在染料—马丁氏液体培养基培养条件下，黑曲霉对不同色素的脱色能力差异显著，对孟加拉红和结晶紫的脱色能力很强，达93.93%，藏花红仅为30.26%，亚甲基蓝为57.68%，而菌体的干重均为0.17 g。虽然液体培养条件和固体培养条件有一定的差异，但总体上差别不显著，这表明可以用固体培养的方法做脱色菌的初筛方法，再通过液体发酵的复筛，找到有潜力的脱色菌株。

3 讨论

孟加拉红（又名虎红钠盐，分子式为C20H2Cl4I4Na2O5，结构式见图4）既是一种染料（染料索引号为C.I.45440），也是一种在真菌分离中广泛应用的细菌和放线菌的抑菌剂；孟加拉红分子中既含有氧蒽结构又具有三苯烷结构，表明能降解孟加拉红的生物可能具有广泛的染料降解谱[9]；因此，选用孟加拉红作为菌种脱色处理用染料。

用紫外分光光度计对孟加拉红染料进行全波长扫描（200～800 nm），确认其在可见光范围内的最大吸光度的波长为546 nm（图5），测定所得的OD值以OD546表示，以此来检测所筛真菌的脱色效果。

以脱色圈法筛选有脱色能力的真菌，不需要特殊的试剂，方法简单、费用较低，筛选出的真菌菌体能分泌降解色素的物质或富集培养基里的色素。该方法可以作为筛选其他脱色能力的微生物的常用方法。

[1]中华人民共和国环境保护部.2007年全国水质环境质量状况.2009.02.03.http：//www.mep.gov.cn/cont/swrkz/shzl/200902/t20090203_133891.htm.

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[8]沈 萍，范秀容，李广武，等.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2004.214-222.

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