流式细胞术定量检测外周血单个核细胞NF-κB的方法探讨

郭晓红,贾永平,姚海东,刘志苹

核因子-κB(nuclear fac tor-kappa B,NF-κB)是细胞内一种重要的核转录因子,处于各种细胞因子网络调节的中心环节,在机体生理和病理条件下发挥重要功能,日益受到人们重视。近年来研究[1]发现NF-κB活性变化可能与冠心病的预测、危险分层及预后有关,从而为其早期诊断治疗、判断预后提供理论依据。故快速、灵敏、特异地检测NF-κB活性变化具有重要的临床意义。本研究通过观察NF-κB活性与冠心病冠脉病变之间的关系,探讨应用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测外周血单个核细胞NF-κB活性的实验方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2007年5月—2007年11月在山西医科大学第一医院心内科确诊为冠心病(CHD)的住院患者90例。其中男54例,女36例,年龄45岁～74岁(58.9岁±11.4岁)。根据病情将冠心病患者分为急性心肌梗死(AM I)组、不稳定型心绞痛(UA)组和稳定型心绞痛(SA)组,每组30例。冠心病诊断依据1979年WHO缺血性心脏病诊断标准,排除非冠状动脉血流动力学改变引起的缺血,并且经冠状动脉造影(CAG)证实心外膜下至少一支冠脉狭窄≥50%。所有冠心病患者入院后均接受阿司匹林、他汀类、硝酸酯类等治疗,高血压病、糖尿病患者对症治疗,血压和血糖控制在正常范围。同时另选CAG结果正常者30例作为对照组,其中男16例,女14例,年龄44岁～61岁(52.0岁±8.3岁)。所有患者均排除严重心、肝、肾功能不全,急、慢性感染,恶性肿瘤和自身免疫性疾病。冠心病组与对照组年龄、性别、血压、体重指数比较无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 主要试剂 Cycle TESTTM PLUS DNA试剂盒(美国Becton Dickinson公司产品),其中包括A液、B液和PI染液;NF-κB p65鼠单克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品);FITC标记IgG(美国Jackson公司产品);自制红细胞裂解液(KHCO31.0 g,NH4Cl 8.3 g,EDTA-Na20.037 g,pH 7.2)。FACSCalibur流式细胞仪,美国BECTON DICK INSON公司产品。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 所有入选病例取EDTA抗凝静脉血2 m L,AM I和UA患者在发病24 h内采血。

1.3.2 单细胞悬液制备 取EDTA抗凝血75μL,加红细胞裂解液2m L,室温静置25m in～30 min,离心(2 000 r/m in)5m in,PBS漂洗,然后加A液250μL,静置10 min后加B液200μL,再静置10 m in后即获得单细胞悬液。

1.3.3 染色和计数 用血红蛋白吸管吸取单细胞悬液10μL置载玻片一端,W right-Giem sa染色,镜下证实制备好的单细胞悬液符合要求。往制备好的单细胞悬液中加适量PBS,调整细胞数为1.0×106/m L。

1.3.4 荧光标记 参照Fou lds[2]方法并加以改进,取单细胞悬液500μL加NF-κB p65鼠单克隆一抗工作液25μL(1∶10稀释),轻轻振荡混匀,室温孵育1 h,然后加FITC标记IgG二抗30μL(1∶100稀释),轻轻振荡混匀,避光孵育30 m in,最后加PI染液20μL,轻轻振荡混匀,避光孵育30 m in,3 h内上机检测。每组实验均设阴性对照,阴性对照只加二抗,不加一抗(加等量PBS),余处理同实验组。

1.3.5 流式细胞仪检测标本 校准流式细胞仪,调整荧光变异值(CV)＜3%,获取标本,每一个标本至少获取20 000个细胞数,储存并以Cell Quest软件系统分析结果。

2 结 果

2.1 流式细胞术各分析区的确定 在FSC/SSC散点图中设R1门,代表外周血中单个核细胞区域;在PI/SSC散点图中设R2门,代表PI阳性细胞核区域;在NF-κB FITC荧光直方图中设M 1,代表在PI阳性细胞核中NF-κB p65阳性细胞核所占比例和峰的位置。NF-κB活性变化以其在PI阳性细胞核中的阳性率表示。

2.2 外周血单个核细胞内NF-κB活性变化 AM I组和UA组患者的NF-κB活性与对照组相比较差异有统计学意义(P＜0.01);SA组患者的NF-κB活性与对照组比较无统计学意义(P＞0.05)。详见表1。

表1 流式细胞术检测冠心病患者外周血单个核细胞NF-κB活性变化(±s)

表1 流式细胞术检测冠心病患者外周血单个核细胞NF-κB活性变化(±s)

组别n NF-κB阳性率(%)AM I组30 36.7±8.91)UA组30 12.8±3.41)SA组30 1.8±1.0对照组30 0.8±0.5与对照组比较,1)P＜0.01

3 讨 论

NF-κB广泛存在于真核细胞,通过调控多种细胞因子、趋化因子、黏附分子、生长因子和免疫受体等相关基因表达影响疾病的发生、发展。因此,测定NF-κB活化情况对探讨疾病的发生机制和防治具有重要意义。

在静止细胞中,NF-κB以无活性形式存在于细胞质中,被激活后易位进入细胞核内,引起相应靶基因的转录[3]。传统的检测方法凝胶迁移率电动分析(EMSA)、免疫化学方法、ELISA、免疫荧光显微镜观察等各有优缺点,如EMSA以同位素标记NF-κB特异性寡核苷酸为探针,检测其DNA结合活性[4,5]。该方法虽然灵敏度高,但同位素标记对人体有较大危害性,且操作繁琐、费时,结果重复性差。免疫化学方法和免疫荧光显微镜观察[5],虽然方法简单,但缺乏客观性。ELISA测量法[6]具有操作简便、直接半定量、安全等优点,但其检测标本为血清或血浆,不能客观反映究竟是哪些细胞发生了活性改变。

流式细胞术是近年发展起来的一种新的细胞分析技术,广泛应用于免疫学、肿瘤学、血液学、细胞生物学、细胞遗传学等方面的研究,具有快速、精确、高灵敏、多参数等特点[7]。本研究应用流式细胞术检测冠心病不同病变程度患者外周血单个核细胞的NF-κB活性变化,探讨NF-κB在冠心病发病中的作用。冠心病的基本病变是动脉粥样硬化(AS),而炎症和免疫反应的激活是AS发生、发展以及斑块不稳定的主要因素[8]。研究表明[9],NF-κB是炎症过程的主要调控因子,被激活后可诱导单核细胞趋化因子(MCP)、血小板源性生长因子(PDGF)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等与AS有关的调控基因,从而促进AS斑块的发展。本研究结果显示AM I组和UA组患者的NF-κB活性明显高于对照组(P＜0.01),SA组患者的NF-κB活性与对照组相比无统计学意义,NF-κB活性随病变程度的加重而增高。提示NF-κB可能参与了冠心病的发病过程,其激活在AS病变发生发展过程中发挥着重要作用。与国内外的一些相关报道相同[10-12]。

流式细胞术最大优点就是细胞的分析检测均以单个细胞为基础,通过识别细胞标记物的特异荧光,确定来源细胞,并且可以快速、准确地定量分析细胞内的细胞因子。与传统的检测方法相比较,应用流式细胞术检测外周血单个核细胞的NF-κB活性,不仅标本来源简便,而且检测时间大大缩短,操作步骤简单,方法灵敏、特异,具有其他方法不可比拟的优势。但不论何种检测方法,都应结合临床进行综合评价,才有其实用价值。

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