替米沙坦对大鼠离体胸主动脉环的舒张作用1)

姚 雷,梁月琴,任俊杰,陈 媛,武冬梅,王 君,张轩萍,许慧玉,张 军

血管紧张素Ⅱ1受体(AT1)拮抗剂(ARBs)是目前国际上推荐的五大类降压药中作为降压治疗的一线药物之一。在国内应用很普遍,它是继血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)之后的一类作用于肾素-血管紧张素系统(RAS)的重要药物。替米沙坦作为对AT1亲和力最强的ARBs,它选择性、不可逆转地拮抗AngⅡ的AT1受体而不影响包括心血管调节的其他受体系统[1]。它可以松弛血管平滑肌,增加盐类排泄[2]。现有的研究认为,替米沙坦主要是通过拮抗AT1受体而发挥舒张血管的作用,为了研究替米沙坦在舒张血管平滑肌的过程中是否有AT1受体以外的机制参与,本实验从调节血管张力的角度出发,观察了替米沙坦对大鼠离体胸主动脉环张力的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 替米沙坦:江苏中邦制药有限公司,批号20081206;左旋硝基精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME):Sigma公司,批号 511K1351;吲哚美辛(Indomethacin,Indo):Sigma公司,批号 065N7764;去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE):Sigma公司,批号086K1540;其余均为化学试剂国产分析纯。BL-420F计算机生物信号采集分析系统(成都泰盟科技有限公司);张力换能器(FT-100,成都泰盟科技有限公司);数字式超级恒温浴锅(HH-501,常州国华电器有限公司)。

1.2 实验动物 Sprague-Dawley(SD)大鼠,雄性,月龄2个月～3个月,体重250g～300g,由山西医科大学动物实验中心提供。动物饲养条件:每笼2只,自由摄食饮水,饲养温度为20℃～25℃,相对湿度40%～70%。用山西医科大学动物实验中心提供的标准块料饲养。

1.3 标本制备 以断头法处死大鼠,迅速打开胸腔,分离胸主动脉,将取下的胸主动脉置入预冷预先通氧、pH值为7.4的生理盐溶液(PSS)中,成分为:NaCl 144 mmol/L,KCl 5.8 mmol/L,MgCl21.2mmol/L,CaCl22.5mmol/L,Glucose11.1mmol/L,HEPES 5 mmol/L。去除血管周围的脂肪及结缔组织,将动脉剪成2 mm～3 mm的血管环,血管环用两根不锈钢微型挂钩从管腔穿过,水平悬挂在浴管内,下方固定,上方以一细钢丝连于张力换能器,经BL-420F计算机生物信号采集分析系统记录血管环的张力变化。浴管内含有通以100%氧、pH值为7.4、37℃的生理盐溶液,前负荷调为2 g,平衡1 h后开始实验。每20 min换一次营养液。所有动脉环用60 mmol/L-KCl PSS液2次刺激,收缩稳定后,开始正式实验。去内皮的实验,将修剪干净的胸主动脉环两端固定,用与血管内径相适的棉棒从管腔擦过,连续2次。血管环悬挂稳定1 h后,用60 mmol/L KCl HEPES液刺激,达到坪值后加入 Ach(10-5mol/L),舒张幅度不超过收缩幅度的5%时认为内皮去除完全,可开始实验。

1.4 方法 ①张力平衡后,用NE(1×10-6mol/L)分别预收缩内皮完整和去内皮的血管,达到坪值后,以10 min的间隔累积加入1×10-9mol/L,1×10-8mol/L,1×10-7mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L的替米沙坦,对照组加入等容量的生理盐水,描记张力曲线。②张力平衡后,同样用NE(1×10-6mol/L)预收缩血管,达到坪值后,加入内皮型一氧化氮合酶(eNOS)抑制剂L-NAME(1×10-4mol/L)、环氧合酶抑制剂Indo(1×10-5mol/L)再次达到坪值后,以10 min的间隔累积加入1×10-9mol/L,1×10-8mol/L,1×10-7mol/L,1×10-6mol/L,1×10-5mol/L的替米沙坦,描记张力曲线。③1、2、3号浴管内血管稳定后加入NE10-6mol/L,血管环收缩达坪值后用PSS液洗脱,并平衡1 h,然后用无钙PSS液连续冲洗3次,并孵浴 3 min,之后在 1、2、3号浴管内分别加入溶剂、替米沙坦 1×10-8mol/L、替米沙坦 1×10-5mol/L,孵浴20 min,然后分别加入NE1×10-6mol/L,可见血管环产生迅速而短暂的收缩,待其舒张并平稳后,向各管内加入CaCl22.5 mmol/L,可见血管环再次收缩并达峰值,描记张力曲线。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件系统进行统计学分析。数据以均数±标准差(±s)表示,采用两独立样本 t检验,检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 替米沙坦对NE预收缩的大鼠离体胸主动脉环的直接舒张作用以及内皮对其作用的影响 替米沙坦对NE(1×10-6mol/L)预收缩的离体胸主动脉环产生浓度依赖性的舒张作用,其logEC50为-7.1±0.7,与溶剂对照组相比,张力变化有统计学意义(P＜0.01)。替米沙坦对NE(1×10-6mol/L)预收缩的去内皮离体胸主动脉环产生浓度依赖性的舒张作用,其logEC50为-6.2±0.3,与内皮完整组相比,张力变化有统计学意义(P＜0.01)。详见图1。

图1 替米沙坦和生理盐水对 NE预收缩的大鼠胸主动脉环的作用以及替米沙坦对内皮完整和去内皮血管的作用

2.2 阻断剂对替米沙坦舒血管作用的影响 L-NAME孵浴后,替米沙坦的舒张作用减弱,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。Indo孵浴后,NE诱发的血管张力变化与无阻断药时比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。详见图2。

图2 L-NAME、Indo对替米沙坦在NE预收缩大鼠胸主动脉舒张作用中的影响

2.3 替米沙坦对NE在无钙液中的缩血管效应的影响 在无钙PSS液中,分别加入替米沙坦1×10-8mol/L、1×10-5mol/L,孵 浴20min后,加入NE10-6mol/L,血管环产生迅速而短暂的收缩,收缩幅度和溶剂组比较无统计学意义(P＞0.05),待血管环舒张并平稳后,加入CaCl2至2.5 mmol/L,血管环再次收缩,替米沙坦组收缩幅度与溶剂组比较无统计学意义(P＞0.05)。详见图3。

图3 替米沙坦对NE在无钙液中以及CaCl2中缩血管效应的影响

3 讨 论

替米沙坦是一种新型、长效、低毒、高选择性的二苯四咪唑类AngⅡ1型受体(AT1)拮抗剂[1-3],它通过抑制 AT1,降低总外周血管阻力,增加血管壁的顺应性,降低血管僵硬性,从而对心血管系统发挥重要的保护作用[4]。

研究表明替米沙坦可能通过促进ACE22表达及拮抗AngⅡ对ACE22表达的抑制作用这些对AT1的阻断作用以外的途径来产生降压及心血管保护作用[5]。为了研究替米沙坦在舒张血管平滑肌的过程中是否AT1受体以外的机制参与,本实验主要观察替米沙坦对大鼠离体胸主动脉环张力的直接舒张作用。

实验表明,替米沙坦对内皮完整和去内皮血管环均有舒张作用,且去除内皮后,其舒张作用减弱。因此,替米沙坦对血管的舒张作用由两部分组成,部分作用于内皮的舒张机制,部分直接作用于血管平滑肌。

内皮细胞释放的血管舒张物质在血管平滑肌张力的调节过程中起重要的作用[6,7],即EDRF/NO、前列腺环素(PGI2)和内皮细胞超极化因子(EDHF)。其中NO是内皮细胞释放的最重要的舒血管物质,对于血管基础张力的维持至关重要[6,8]。内皮源性NO释放受抑制导致内皮相关的血管舒张作用减弱[9]。NO可通过NO-sGC-cGM P途径,使鸟苷酸环化酶(sGC)激活促使cGMP生成,后者则进一步作用于cGMP依赖性蛋白激酶使Ca2+内流减少,增加Ca2+-ATP酶对Ca2+的摄取,或直接使收缩蛋白去磷酸化舒张血管[10]。eNOS抑制剂 LNAM E处理血管后,发现在NE预收缩的基础上替米沙坦的舒张血管作用部分被阻断,提示NO途径可能参加替米沙坦的舒张血管作用。另一舒血管物质是PGI2是由COX催化花生四烯酸产生的,加入环氧合酶抑制剂Indo后,替米沙坦的舒张血管作用未被阻断,提示PGI2未参与替米沙坦的舒血管作用。

Ca2+在血管平滑肌收缩中起关键作用[11],血管平滑肌收缩所需要的Ca2+源于细胞外内流和细胞内释放。研究表明,NE在无Ca2+PSS液中引起的短暂收缩是细胞内Ca2+释放的结果[12],加入CaC12后引起血管平滑肌进一步收缩被认为是细胞外Ca2+内流的结果[13]。本实验采用无Ca2+液和复Ca2+液的实验方法,发现高浓度和低浓度的替米沙坦都不能抑制NE在无Ca2+液中所引起的血管平滑肌短暂收缩和复Ca2+后的持久收缩,证明了替米沙坦不通过对血管环外钙依赖性收缩和内钙依赖性收缩的影响来发挥舒血管作用。

替米沙坦对NE预收缩的大鼠胸主动脉环具有浓度依赖性的舒张作用,其舒张反应可能有内皮依赖性,与内皮产生的NO有关,与PGI2的合成无关,不通过抑制外钙内流和内钙释放发挥舒张作用。

[1] Kakuta H,Sudoh K,Sasamata M,et al.Telmisartan has the strongest binding affinity to angiotensinⅡtype 1 receptor:Comparison with other angiotensinⅡtype 1 recepto r blockers[J].Int J Clin Pharmacol Res,2005,25(1):41-46.

[2] Yuan H,Ye XH.AngiotensinⅡrecepto r antagonist[M]//Yuan H,Yang C.Elder hypertension.Beijing:People's Medical Publishing House,2002:121-124.

[3] Masakuni O,Yamato M,Sasaki T.Effects of telmisartan on home blood pressure and BNP levels in patients with chronic heart failure and hypertension[J].J Cardiac Failure,2004,10(5):S186.

[4] Sharpe M,Jarvis B,Goa KL.Telmisartan:A reviw of its use in hypertension[J].Drug s,2001,61(10):1501-529.

[5] Sun JW,Yao Q L,Ma H.Effect of telmisartan and angiotensinⅡon the expression of angiotensin converting enzyme22 in thoracic aortic smooth muscle cells[J].Chin J A rterio,2008,16(7):519-522.

[6] Moncada S,Palmer RM,Higgs EA.Nitric oxide:Physiology,pathophysiology,and pharmacology[J].Pharmacol Rev,1991,43(2):109-142.

[7] Furchgott RF,Vanhoutte PM.Endothelium-derived relaxing and contracting factors[J].FASEB J,1989,3(9):2007-2018.

[8] Palmer RM,Ferrige AG,Moncada S.Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor[J].Nature,1987,327(6122):524-526.

[9] Palmer RM,Rees DD,Ashton DS,et al.L-arginine is the phy siological precursor for the formation of nitric oxide in endotheliumdependent relaxation[J].Biochem Biophys Res Commun,1988,153(3):1251-1256.

[10] Vaandrager AB,de Jonge HR.Signalling by cGMP-dependent protein kinases[J].Mol Cell Biochem,1996,157(1-2):23-30.

[11] Bolton T B,Gordienko DV,Pucovsk V,et al.Calcium release events in excitation-contraction coupling in smooth muscle[J].Novartis Found Symp,2002,246:154-168.

[12] Huang XN,Hisayama T,Takayanagi I.Endothelin-1 induced contraction of rat aorta:Contributions made by Ca2+influx and activation of contractile apparatus associated with no change in cytoplasmic Ca2+level[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,1990,341(1-2):80-87.

[13] Ehrlich BE,Kaftan E,Bezprozvannaya S,et al.T he pharmacology of intracellular Ca2+-release channels[J].T rends Pharmacol Sci,1994,15(5):145-149.